方勇 魏付橋

乳腺癌是女性死亡的第二大死因。盡管其機(jī)制尚未闡明，但癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附能力的改變是轉(zhuǎn)移發(fā)生的前提[1]。在這一過(guò)程中腫瘤細(xì)胞表達(dá)和分泌一些蛋白酶如基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）分解組織中的基質(zhì)，從而促進(jìn)腫瘤的增生與轉(zhuǎn)移[2-3]。在眾多的MMPs中，其中MMP-9和MMP-2在降解IV型膠原中發(fā)揮重要作用[4]。白藜蘆醇是廣泛存在于各類(lèi)植物中的一種天然多酚，研究顯示其具有多重藥理作用，包括心肌保護(hù)，抑制血小板凝集，抗炎、抗氧化作用以及血管舒張等[5]。此外，白藜蘆醇也能通過(guò)多種機(jī)制調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖，侵襲以及凋亡，因此是一種潛在的高效腫瘤預(yù)防藥物[6]。本研究旨在觀察白藜蘆醇是否能影響乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞MMP-9的表達(dá)，并觀察其抑制效應(yīng)是否與NF-κB有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑 白藜蘆醇和明膠購(gòu)自購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，抗p 65、PCNA、β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz。其他分析純產(chǎn)品分別來(lái)源于上海生工和AMERCO。Transwell chamber和Matrigel分別購(gòu)自Costar和Sigma。

1.2 MCF-7細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7用含10%牛胎兒血清、100 U/mL的青霉素以及100 U/mL的鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（pH 7.4）中在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組和白藜蘆醇處理組 。其中陰性對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)基，而處理組加入不同濃度的白藜蘆醇在37℃下處理實(shí)驗(yàn)細(xì)胞24～72 h。

1.3 Transwell小室檢測(cè)MCF-7細(xì)胞遷移與侵襲 制備密度為2×106/mL的細(xì)胞懸液并加入至Transwell上室。下室加入0.6 mL含20% FBS的培養(yǎng)基及不同濃度的白藜蘆醇。培養(yǎng)結(jié)束后取出Transwell小室，計(jì)算膜下細(xì)胞數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)與遷移類(lèi)似，不同之處是在Transwell濾膜上鋪上Matrigel。細(xì)胞侵襲指數(shù)=處理組穿膜細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞數(shù)。

1.4 明膠酶譜實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，收集上清，加入含1 mg/mL明膠的SDS-PAGE（分離膠10%）。加入含2.5% Triton-X-100復(fù)性液孵育30 min以去除SDS。隨后將凝膠用50mmol/L HCl（pH 7.4），5mmol/L CaCl2和1 μmol/L ZnCl2于37℃下孵育過(guò)夜。加入0.05%考馬斯亮藍(lán)R-250室溫染色30 min，去離子水脫色，拍照，灰度掃描。

1.5 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和熒光素酶報(bào)告基因分析 采用pMMP-9-Luc，pNF-κB-Luc報(bào)告質(zhì)粒分析MMP-9和NF-κB轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)MCF-7細(xì)胞融合度應(yīng)達(dá)到70%～80%時(shí)，共轉(zhuǎn)入0.2μgmmP-9或NF-κB報(bào)告基因質(zhì)粒以及0.2μg pSV-β-半乳糖苷酶并培養(yǎng)24 h。根據(jù)試劑盒（Promega）操作步驟，采用光測(cè)定儀獲取螢光素酶和β-半乳糖苷酶活性。裂解細(xì)胞后，獲取3次實(shí)驗(yàn)的平均值，以β-半乳糖苷酶活性為內(nèi)參照，得到標(biāo)化的螢光素酶活性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用one-way方差分析并行Student’s t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)MCF-7遷移和侵襲的影響 MCF-7細(xì)胞與12.5～100 μmol/L白藜蘆醇孵育24 h后，其遷移率和侵襲力隨著濃度的增加而降低。當(dāng)白藜蘆醇濃度為50 μmol/L時(shí)，其遷移與侵襲率分別降低了34%和30%（見(jiàn)圖1）。

2.2 白藜蘆醇對(duì)MCF-7細(xì)胞MMP-9活性的影響 明膠酶譜實(shí)驗(yàn)顯示，12.5～100 μmol/L白藜蘆醇孵育24 h后，MMP-9活性隨著濃度的增高而降低，其中白藜蘆醇為100 μmol/L時(shí)，其活性降低了 56%（見(jiàn)圖2）。

圖1 白藜蘆醇對(duì)MCF-7細(xì)胞侵襲和遷移的影響

圖2 白藜蘆醇對(duì)MCF-7細(xì)胞內(nèi)MMP-9酶活性的影響

圖3 白藜蘆醇經(jīng)抑制NF-κB的活性而抑制MMP-9轉(zhuǎn)錄

2.3 白藜蘆醇通過(guò)抑制PMA誘導(dǎo)的NF-κB活性而抑制MMP-9的轉(zhuǎn)錄

報(bào)告基因結(jié)果顯示，白藜蘆醇能以劑量依賴(lài)性方式抑制MMP-9的啟動(dòng)子的活性，而NF-κB缺失突變株（-580/+13和-450/+13）啟動(dòng)子活性輕微受影響（見(jiàn)圖3）。

3 討論

目前臨床用于腫瘤預(yù)防與化療的藥物當(dāng)中，70%來(lái)自天然植物。白藜蘆醇是一種生物性很強(qiáng)的天然多酚類(lèi)物質(zhì)，大量存在于紅葡萄酒中。此外，花生紅衣與仁中也含有相當(dāng)多的白藜蘆醇。白藜蘆醇的實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)具有對(duì)心血管疾病和癌癥的有益作用[7]。 白藜蘆醇對(duì)激素依賴(lài)性腫瘤（包括乳腺癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌等）有明顯的預(yù)防作用[6-8]，但并沒(méi)有相關(guān)的系統(tǒng)性研究方面的報(bào)道。因此，白藜蘆醇確切的抗腫瘤分子機(jī)制依然有待進(jìn)一步研究。在本研究中，我們對(duì)白藜蘆醇對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖進(jìn)行了探討，結(jié)果證實(shí)：（1）白藜蘆醇能抑制MMP-9的表達(dá)與活性；（2）白藜蘆醇能抑制NF-κB的激活從而抑制NF-κB介導(dǎo)的MMP-9的表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲。MMP-9基因轉(zhuǎn)錄收上游啟動(dòng)序列的調(diào)控，如AP-1、NF-κB以及SP-1等。我們采用突變的報(bào)告質(zhì)粒對(duì)MMP-9啟動(dòng)子活性進(jìn)行了探討。當(dāng)NF-κB結(jié)合位點(diǎn)突變后，白藜蘆醇對(duì)MMP-9的抑制效應(yīng)消失。這表明NF-κB參與了MMP-9的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。而白藜蘆醇通過(guò)抑制NF-κB p 65亞基的核轉(zhuǎn)位，最終抑制MMP-9的表達(dá)及酶活性，從而最終抑制MCF-7細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

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