李 松，趙芝煥，傅煒萍，劉 凌，戴路明

α-烯醇化酶是烯醇化酶家族中3種同工酶之一，是一種多功能蛋白，作為糖酵解過(guò)程中的關(guān)鍵酶，α-烯醇化酶廣泛分布于原核和真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，其基因表達(dá)隨細(xì)胞病理生理、代謝、發(fā)育狀況的不同而改變[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，肌細(xì)胞α-烯醇化酶可以與微管骨架系統(tǒng)相互作用，形成三磷腺苷(ATP)生成的能量核心，以便及時(shí)為肌肉提供收縮運(yùn)動(dòng)所需能量[2]，提示α-烯醇化酶的表達(dá)與肌肉的功能狀態(tài)有關(guān)。本研究通過(guò)測(cè)定α-烯醇化酶及其mRNA在肺腺癌、慢性阻塞性肺疾病(COPD)合并肺腺癌患者肋間肌中的表達(dá)情況，旨在探討α-烯醇化酶在COPD中的調(diào)控情況，對(duì)進(jìn)一步了解COPD的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年4—10月就診于昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科需行開(kāi)胸腫瘤切除術(shù)的住院患者28例。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)心、肝、腎功能障礙；(2)合并內(nèi)分泌代謝障礙疾?。?3)合并風(fēng)濕性結(jié)締組織疾?。?4)合并嚴(yán)重消化系統(tǒng)疾?。?5)近4周內(nèi)全身使用過(guò)糖皮質(zhì)激素；(6)合并其他部位的感染；(7)有其他器官惡性腫瘤病史；(8)術(shù)前經(jīng)過(guò)放療或化療，接受靶向藥物治療、生物治療等。根據(jù)術(shù)后腫瘤組織病理類型和中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸學(xué)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組頒布的《慢性阻塞性肺疾病診療指南》(2008年修訂版)中的診斷標(biāo)準(zhǔn)分為肺腺癌組12例和COPD合并肺腺癌組16例。其中肺腺癌組發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移6例，無(wú)轉(zhuǎn)移6例；低分化3例，中分化6例，高分化3例。COPD合并肺腺癌組發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移6例，無(wú)轉(zhuǎn)移10例；低分化5例，中分化6例，高分化5例。兩組患者性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；肺腺癌組第1秒用力呼氣末容積占預(yù)計(jì)值百分比(FEV1/Pred)、第1秒用力呼氣末容積占用力肺活量百分比(FEV1/FVC)、氧分壓(PO2)高于COPD合并肺腺癌組，二氧化碳分壓(PCO2)低于COPD合并肺腺癌組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。收集兩組患者肋間肌標(biāo)本，均來(lái)源于手術(shù)治療，經(jīng)病理檢查確診。標(biāo)本儲(chǔ)存于-80 ℃液氮中。本研究經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意，患者均簽署知情同意書(shū)。

表1 兩組患者一般資料比較

注：△為χ2值；COPD=慢性阻塞性肺疾病，F(xiàn)EV1/Pred=第一秒用力呼氣末容積占預(yù)計(jì)值百分比，F(xiàn)EV1/FVC=第一秒用力呼氣末容積占用力肺活量百分比，PO2=氧分壓，PCO2=二氧化碳分壓；1 mm Hg=0.133 kPa

1.2 試劑與方法 采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR(RT-PCR)測(cè)定α-烯醇化酶mRNA表達(dá)水平，根據(jù)TRIzol試劑盒(購(gòu)于Invitrogen公司)說(shuō)明書(shū)提取總RNA，總RNA的純度和水平采用紫外檢測(cè)儀測(cè)定，經(jīng)測(cè)定所有樣品的A260/A280比值在1.8～2.0，反轉(zhuǎn)錄過(guò)程按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)于北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司)說(shuō)明書(shū)操作，RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR循環(huán)條件為：(1)95 ℃預(yù)變性2 min；(2)95 ℃變性2 s、59 ℃退火30 s、72 ℃延伸12 s，共50個(gè)循環(huán)；(3)72 ℃延伸5 min。采用ELISA法測(cè)定α-烯醇化酶蛋白水平，試劑盒購(gòu)于北京鑫方程生物技術(shù)有限公司，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 兩組α-烯醇化酶mRNA表達(dá)比較 COPD合并肺腺癌組α-烯醇化酶mRNA表達(dá)水平為(3.53±0.84)，肺腺癌組為(2.36±0.63)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.530，P<0.01)。

2.2 兩組α-烯醇化酶蛋白水平比較 COPD合并肺腺癌組α-烯醇化酶蛋白水平為(1 175.51±219.16)ng/L，肺腺癌組為(1 047.29±120.83)ng/L，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.569，P<0.01)。

2.3 相關(guān)性分析 COPD合并肺腺癌患者肋間肌α-烯醇化酶mRNA表達(dá)水平與性別、年齡、FEV1/FVC、PO2、PaCO2無(wú)直線相關(guān)關(guān)系(r=0.670、0.545、0.498、0.658、0.420，P>0.05)，與FEV1/Pred呈負(fù)相關(guān)(r=-0.713，P<0.05，見(jiàn)圖1)。COPD合并肺腺癌患者肋間肌α-烯醇化酶蛋白水平與性別、年齡、FEV1/FVC、PO2、PaCO2無(wú)直線相關(guān)關(guān)系(r=0.544、0.608、0.435、0.590、0.498，P>0.05)，與FEV1/Pred呈負(fù)相關(guān)(r=-0.819，P<0.05，見(jiàn)圖2)。

圖1 α-烯醇化酶mRNA表達(dá)水平與FEV1/Pred相關(guān)性分析

圖2 α-烯醇化酶蛋白水平與FEV1/Pred相關(guān)性分析

Figure2 Correlation between α-enolase protein concentration and FEV1/Pred

3 討論

α-烯醇化酶可通過(guò)參與調(diào)節(jié)能量代謝來(lái)滿足細(xì)胞生長(zhǎng)所需能量，正常細(xì)胞中90% ATP來(lái)源于線粒體的三羧酸循環(huán)途徑，只有10% ATP由糖酵解途徑產(chǎn)生，并且在氧氣充足的情況下，正常細(xì)胞的糖酵解途徑受到抑制。本研究結(jié)果顯示，COPD合并肺腺癌組肋間肌α-烯醇化酶蛋白水平及mRNA表達(dá)水平均明顯高于肺腺癌組，提示COPD可上調(diào)肋間肌α-烯醇化酶水平。COPD作為一種長(zhǎng)期缺氧的慢性全身性疾病，為維持細(xì)胞的正常代謝及功能所需提供能量，糖酵解途徑的增強(qiáng)在一定程度上可補(bǔ)償機(jī)體能量細(xì)胞的不足。

Kim等[3]研究發(fā)現(xiàn)，呼吸肌的結(jié)構(gòu)和功能與肌肉質(zhì)量、肌肉新陳代謝、肺及全身代謝有關(guān)。肋間肌中含有較高比例的Ⅱ型肌纖維[4]，而Ⅱ型肌纖維中富含烯醇化酶[5]，與Ⅰ型肌纖維比較，烯醇化酶在Ⅱ型肌纖維中有較高的糖酵解活性，而氧化代謝活性則較低。COPD患者肋間肌存在Ⅰ型肌纖維含量減少，Ⅱ型肌纖維含量增加[6]。Keller等[2]研究發(fā)現(xiàn)，肌肉細(xì)胞α-烯醇化酶可以與微管骨架系統(tǒng)相互作用，形成ATP生成的能量核心，以便及時(shí)為肌肉提供收縮運(yùn)動(dòng)所需能量，提示α-烯醇化酶的表達(dá)與肌肉的功能狀態(tài)有關(guān)。中度COPD患者肋間肌糖酵解酶、氧化酶表達(dá)及活性較正常人高，且糖酵解酶及氧化酶表達(dá)隨COPD嚴(yán)重程度加重而增加[7-8]，提示COPD患者肋間肌糖酵解酶的表達(dá)可能與其肋間肌功能狀態(tài)有關(guān)。本研究結(jié)果亦顯示，COPD合并肺腺癌患者肋間肌α-烯醇化酶蛋白水平及mRNA表達(dá)水平與FEV1/Pred呈負(fù)相關(guān)，與性別、年齡、FEV1/FVC、PO2、PCO2無(wú)直線相關(guān)關(guān)系。提示COPD患者肋間肌α-烯醇化酶水平可能通過(guò)某些調(diào)控機(jī)制與肋間肌功能狀態(tài)發(fā)生相互影響，但其具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

α-烯醇化酶作為一種糖酵解過(guò)程中的關(guān)鍵酶，與GAPDH(一種管家基因)不同，其基因表達(dá)隨細(xì)胞病理生理、代謝、發(fā)育狀況的不同而改變[1]。針對(duì)成纖維細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞的研究表明，在與細(xì)胞表面相應(yīng)的受體結(jié)合后，一些細(xì)胞因子或其他刺激劑通過(guò)活化MAPK/ERK途徑，進(jìn)而激活下游的轉(zhuǎn)錄因子(API，EGRI，CRFB/ATF，C-myc、缺氧誘導(dǎo)因子-1等)，調(diào)控α-烯醇化酶基因的表達(dá)[9-10]。這些轉(zhuǎn)錄因子可通過(guò)其上游結(jié)合位點(diǎn)5-CACGTG-3，與編碼α-烯醇化酶的基因Cis-低氧反應(yīng)元件(HRE)結(jié)合，調(diào)節(jié)α-烯醇化酶啟動(dòng)子的活性，誘導(dǎo)基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，肋間肌α-烯醇化酶mRNA表達(dá)水平與α-烯醇化酶蛋白水平定量呈現(xiàn)一致性表現(xiàn)，提示mRNA表達(dá)水平升高，其蛋白水平定量也升高；相反，mRNA表達(dá)水平降低，其蛋白水平定量也降低。說(shuō)明COPD可能通過(guò)調(diào)控α-烯醇化酶上游基因使肋間肌α-烯醇化酶 mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)異常，從而影響其肋間肌功能狀態(tài)。

本研究通過(guò)探討α-烯醇化酶在COPD中的調(diào)控作用，從側(cè)面了解COPD患者呼吸肌功能調(diào)控情況，對(duì)進(jìn)一步了解COPD發(fā)病機(jī)制具有一定意義，但本研究仍存在以下局限性：(1)由于受研究對(duì)象條件的限制及標(biāo)本保存時(shí)間的制約，可獲取的樣本數(shù)量少；(2)本研究雖然發(fā)現(xiàn)COPD肋間肌α-烯醇化酶可能通過(guò)某些調(diào)控機(jī)制與肋間肌功能狀態(tài)發(fā)生相互影響，但其具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。因此，筆者下一步將著手于更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑囼?yàn)方案，增大樣本例數(shù)，使結(jié)果更具有代表性。

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