王學(xué)榮，張劍青，趙芝煥，方利洲，戴路明

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 呼吸二科，云南 昆明 650032）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease,COPD）不僅僅累及肺臟，它還是一種涵蓋了骨骼肌萎縮和功能障礙、骨質(zhì)疏松癥和全身炎癥反應(yīng)等多系統(tǒng)的疾病[1]，其中骨骼肌萎縮嚴(yán)重影響COPD患者生活質(zhì)量及預(yù)后[2]。先期的研究發(fā)現(xiàn)β烯醇化酶在COPD骨骼肌萎縮患者中表達(dá)明顯上調(diào)[2]，而其上調(diào)的原因和意義目前尚不清楚，本研究通過(guò)檢測(cè)COPD骨骼肌萎縮者及非萎縮者的股四頭肌外側(cè)肌組織β烯醇化酶及其mRNA表達(dá)水平差異，探討COPD骨骼肌萎縮組和非萎縮組其下肢骨骼肌β烯醇化酶的表達(dá)情況。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象 我院2012年5月－2013年3月因股骨骨折、行內(nèi)固定取出術(shù)或行股骨頭置換術(shù)需入住昆明醫(yī)醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科手術(shù)診療且確診為COPD的患者26例。所入選患者符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組頒布的《慢性阻塞性肺疾病診療指南》（2013年修訂版）診斷標(biāo)準(zhǔn)：吸入支氣管擴(kuò)張劑后FEV1/FVC<70%并以FEV1%預(yù)計(jì)值來(lái)評(píng)估COPD嚴(yán)重程度，所選病人均為COPD穩(wěn)定期，在入院前三月之內(nèi)無(wú)急性加重，并且排除肢體功能障礙的神經(jīng)系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重消化道疾病、近4周使用過(guò)激素及抗生素、內(nèi)分泌代謝性疾病、腫瘤疾病、營(yíng)養(yǎng)代謝異常性疾病及有智力障礙或認(rèn)知障礙者。根據(jù)患者BMI、去脂肪指數(shù)（FFMI），分為COPD骨骼肌萎縮組和COPD骨骼肌非萎縮組，標(biāo)準(zhǔn)為：BMI≤21kg/m2及FFMI≤16kg/m2（男）或FFMI≤15kg/m2（女）。手術(shù)過(guò)程中直接取股四頭肌。

對(duì)照組11例，為同期因骨折入住我院骨科的年齡匹配老年人，其中男6例，女5例，平均（71.0±4.0）歲；BMI（25.4±1.6）kg/m2；去脂肪指數(shù)（17.8±1.5）kg/m2；股四頭肌周徑（42.9±3.8）cm。在患者實(shí)施手術(shù)過(guò)程中直接于取材部位取股四頭肌做樣本。

本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意，并與入選者簽訂知情同意書(shū)。受試者的基本資料見(jiàn)附表。

二、方法 1．Western blot檢測(cè)β-enolase蛋白：從三組受試對(duì)象的股四頭肌肌肉標(biāo)本的細(xì)胞中提取總蛋白質(zhì)，然后采用十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)經(jīng)分離后從凝膠中轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，經(jīng)固定和封閉后，進(jìn)行抗體雜交，先加入未標(biāo)記特異性抗體（Ab1）與膜上抗原結(jié)合，再加入標(biāo)記的抗抗體（Ab2）進(jìn)行雜交檢測(cè)，然后用辣根過(guò)氧化物酶法，即增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測(cè)，并利用X線膠片感光原理，記錄結(jié)果。

2．熒光定量RT-PCR檢測(cè)β-enolasem RNA水平：我們從三組研究對(duì)象的股四頭肌肌肉標(biāo)本的細(xì)胞中，提取總RNA，然后進(jìn)行cDNA合成，通過(guò)GenBank基因數(shù)據(jù)庫(kù)搜索下列β-烯醇化酶基因完整mRNA序列，用BLAST分析尋找特異性最好的一段設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)軟件為primer 5.0，引物序列（5'-3）'：F:TCCTTGGCTTACCTGACCTCTT，R:TCCACGGACCCCCTTTTATA。然后通過(guò)合理的實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，通過(guò)Ct值（預(yù)循環(huán)數(shù)）對(duì)模板進(jìn)行相對(duì)定量。

附表 3組受試對(duì)象基本資料

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)用（±s）表示。2組均數(shù)比較用獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)（independent samplet tes）t，多組均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析（one way ANOVA），對(duì)于不滿足于方差分析條件的（方差不齊時(shí)），使用非參數(shù)檢驗(yàn)H檢驗(yàn)，組間比較以算出P值，Bonferroni法調(diào)整檢驗(yàn)水平，再行比較。

結(jié) 果

一、β烯醇化酶Western blot蛋白檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照組β-烯醇化酶表達(dá)相對(duì)比例為（1.000±0.072），COPD骨骼肌非萎縮組β-烯醇化酶表達(dá)相對(duì)比例為（1.03±0.075），COPD骨骼肌萎縮組β-烯醇化酶表達(dá)相對(duì)比例為（1.200±0.078）。三組中β-烯醇化酶蛋白表達(dá)具有差異性（F=10.4，P＜0.05），進(jìn)一步兩兩比較，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，COPD骨骼肌萎縮組中β-烯醇化酶蛋白表達(dá)明顯高于COPD骨骼肌非萎縮組、對(duì)照組，COPD骨骼肌非萎縮組β-烯醇化酶蛋白表達(dá)高于對(duì)照組。對(duì)照組與COPD骨骼肌非萎縮組P值=0.0005，對(duì)照組與COPD骨骼肌萎縮組P值0.0001，COPD骨骼肌非萎縮組與COPD骨骼肌萎縮組P值=0.0001。Western blot見(jiàn)圖1。

COPD骨骼肌萎縮組與正常對(duì)照組中β-烯醇化酶蛋白表達(dá)具有差異性（P＜0.05）

二、β-烯醇化酶mRNA熒光定量PCR結(jié)果

COPD骨骼肌萎縮組、COPD骨骼肌非萎縮組、正常對(duì)照組患者股四頭肌β-烯醇化酶mRNA表達(dá)具有差異性（F=7.98，P＜0.05），進(jìn)一步兩兩比較，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，COPD骨骼肌萎縮組中β-烯醇化酶mRNA表達(dá)明顯高于COPD骨骼肌非萎縮組、正常對(duì)照組，COPD骨骼肌非萎縮組β-烯醇化酶mRNA表達(dá)高于正常對(duì)照組。對(duì)照組與COPD骨骼肌非萎縮組P值=0.087，對(duì)照組與COPD骨骼肌萎縮組P值=0.001，COPD骨骼肌非萎縮組與COPD骨骼肌萎縮組P值=0.0001，見(jiàn)圖2。

三、COPD骨骼肌萎縮組及非萎縮組中β-烯醇化酶蛋白濃度及β-烯醇化酶mRNA表達(dá)水平一致升高，有一定的正相關(guān)性，COPD骨骼肌萎縮組β-烯醇化酶蛋白及β-烯醇化酶mRNA相關(guān)性分析（R=0.6312、P=0.0029），COPD骨骼肌非萎縮組β-烯醇化酶蛋白及β-烯醇化酶mRNA相關(guān)性分析（R=0.5624、P=0.0058）。

討 論

圖1 Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 mRNA熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

COPD骨骼肌萎縮的發(fā)生是一種多因素、多種分子生物學(xué)機(jī)制共同參與的復(fù)雜過(guò)程，其中包括缺氧、氧化應(yīng)激、高碳酸血癥、營(yíng)養(yǎng)不良、局部或者系統(tǒng)性炎癥、蛋白質(zhì)合成與降解失衡、遺傳易感性、日常活動(dòng)減少等多種因素。在病理狀態(tài)下，COPD患者肌纖維降解和合成失衡，從而出現(xiàn)肌纖維類型及氧化表型改變，導(dǎo)致骨骼肌功能障礙。β-烯醇化酶可能也參與了COPD骨骼肌功能障礙的發(fā)病機(jī)制[3]。

β-enolase主要分布于骨骼肌和心臟（橫紋肌）的肌細(xì)胞內(nèi)，是肌肉特異性烯醇化酶（MSE）；烯醇化酶是一種多功能蛋白，其多樣性主要體現(xiàn)在細(xì)胞定位和功能上[4]。

本研究結(jié)果顯示，COPD骨骼肌萎縮組及非萎縮組患者股四頭肌β-烯醇化酶及mRNA較正常組高，其原因較為復(fù)雜，首先，β-烯醇化酶是一個(gè)關(guān)鍵的糖酵解酶，可通過(guò)參與調(diào)節(jié)能量代謝來(lái)滿足細(xì)胞生長(zhǎng)所需能量。COPD存在缺氧，機(jī)體可通過(guò)代償增加糖酵解酶的表達(dá)和葡萄糖載體的生成，以增加細(xì)胞對(duì)缺氧的代謝適應(yīng)[5]。其次，在COPD患者骨骼肌中存在的復(fù)雜病理因素也有可能影響動(dòng)態(tài)的β-烯醇化酶的清除，造成β-烯醇化酶的相對(duì)堆積。這種升高的內(nèi)在機(jī)制可能是COPD的病理過(guò)程的某些因素直接或間接作用于DNA上游調(diào)控區(qū)啟動(dòng)基因，使β-烯醇化酶及mRNA表達(dá)增高。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，COPD骨骼肌萎縮組和非萎縮組中β-烯醇化酶都隨β-烯醇化酶mRNA表達(dá)量的增加而增加，有一定的正相關(guān)性，通過(guò)增加β-烯醇化酶mRNA的量而使β-烯醇化酶增加，可能與COPD病理過(guò)程的某些因素啟動(dòng)DNA上游調(diào)控區(qū)啟動(dòng)基因增加mRNA表達(dá)量有關(guān)。但COPD骨骼肌萎縮組和非萎縮組β-烯醇化酶及β-烯醇化酶mRNA表達(dá)量存在差異，在COPD萎縮組骨骼肌β-烯醇化酶mRNA保有量相對(duì)較多，β-烯醇化酶保有量相對(duì)較少，可能與轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)、翻譯水平下降，同時(shí)還可能與COPD骨骼肌萎縮組患者蛋白消耗有關(guān)。在COPD非萎縮組骨骼肌β-烯醇化酶mRNA保有量（即實(shí)際應(yīng)該的產(chǎn)生量，除去受某些因素影響而減少或增加的量）相對(duì)較少，β-烯醇化酶保有量相對(duì)較多，可能與轉(zhuǎn)錄下調(diào)、β-烯醇化酶mRNA壽命縮短、降解加快、翻譯加速有關(guān)。提示可能不同的病理、遺傳因素和調(diào)控機(jī)制在COPD骨骼肌萎縮組和非萎縮組對(duì)β-烯醇化酶的上調(diào)發(fā)揮了不同作用。

β-烯醇化酶在COPD患者中表達(dá)明顯增加，且在COPD萎縮組及非萎縮組中表達(dá)水平不同，可能與上游DNA、mRNA調(diào)控機(jī)制不同有關(guān)。這種復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步研究。此外β-烯醇化酶在COPD患者骨骼肌萎縮的作用如何，也值得深入探討。

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