寧金梅，吳 平，趙樹波，劉德華，楊明早，朱 媛，孫 勇

（1．曲靖市第一人民醫(yī)院 耳鼻咽喉科，云南 曲靖 655000；2．昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 耳鼻喉科，云南 昆明 650101）

近年來隨著生活水平的提高，嗓音疾病漸漸被人重視。聲帶息肉是臨床上的常見病及多發(fā)病，多見于成人，男女均可發(fā)病，是引起聲音嘶啞的常見原因之一。常發(fā)生于一側(cè)聲帶前、中三分之一交界處的邊緣，有蒂或廣基，也可雙側(cè)均發(fā)生。隨著社會交流的增多，環(huán)境污染問題的加劇，其發(fā)病率有明顯上升趨勢，直接影響人們的生理和心理健康。聲帶的結(jié)構(gòu)分為鱗狀上皮層、固有層淺層、固有層中層、固有層深層和聲帶肌層五層。任克氏間隙（Reinke'sspace）是位于聲帶上皮下與聲韌帶之間的一個柔軟的、含有無定形物質(zhì)的潛在間隙，其形態(tài)和張力決定了聲帶的振動特點，是一個具有高度特異性的結(jié)締組織屏障，全層幾乎沒有淋巴引流，主要為細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）和成纖維細(xì)胞（fibroblast,Fb），是聲帶息肉的好發(fā)部位。聲帶息肉的發(fā)病原因有以下學(xué)說：⑴吸煙；⑵循環(huán)障礙學(xué)說；⑶炎癥學(xué)說；⑷機(jī)械創(chuàng)傷學(xué)說；⑸內(nèi)分泌紊亂；⑹變態(tài)反應(yīng)。另外，近年來臨床研究發(fā)現(xiàn)特殊類型的聲帶息肉與胃食管反流發(fā)生有著密切關(guān)系，胃食管反流的反流物含有不同成分，其中胃酸和胃蛋白酶是損傷咽喉粘膜的主要成分，長期刺激咽喉組織，引起聲帶彌漫性充血水腫，嚴(yán)重時出現(xiàn)聲帶小結(jié)、聲帶息肉。導(dǎo)致聲帶息肉的形成可能是多方面因素共同作用的結(jié)果，而其中某一方面起主導(dǎo)作用。但是什么因素作用導(dǎo)致聲帶結(jié)構(gòu)的改變，生成息肉，并不是十分清楚。

MMP-9能有效降解明膠和基膜的主要成分Ⅳ，Ⅴ，Ⅶ，Ⅹ型膠原，其高表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)和血管基底膜降解加速，在多種炎癥性和腫瘤性疾病致病過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)MMP9的基質(zhì)降解作用比MMP2高出近25倍，MMP9在粘膜內(nèi)胃癌轉(zhuǎn)移中的作用比MMP2更強(qiáng)[1-4]。目前已證實，高表達(dá)的MMP-9與腫瘤血管生成、細(xì)胞增殖、凋亡抑制、細(xì)胞免疫抑制等都有十分密切的關(guān)系，所以研究聲帶息肉中MMP-9的表達(dá)也許可以為研究聲帶息肉的發(fā)生機(jī)制提供一些線索。

材料與方法

一、臨床資料 實驗組：選擇近年聲帶息肉患者標(biāo)本35例，其中男性22例，女性13例，年齡24-62歲，平均年齡為41歲，病程1月至8年，均經(jīng)病理診斷確診，且排除其他聲帶病變。所有患者均為初次手術(shù)。對照組：正常聲帶組織標(biāo)本18例（因非喉部疾病死亡24-48h內(nèi)的尸體標(biāo)本，或病理科保存的正常聲帶組織標(biāo)本蠟塊）。

二、試驗方法：2組標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，作4μm厚的連續(xù)切片，HE染色，選取標(biāo)本中細(xì)胞成分多的部位作切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

三、結(jié)果判斷 陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：與邁新公司的陽性對照片中陽性細(xì)胞相比。相同或比其深者為陽性，比其弱或沒有染色者為陰性。MMP-9以細(xì)胞漿出現(xiàn)黃色為陽性細(xì)胞，將每張切片著色強(qiáng)度與著色細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行分級。陽性細(xì)胞計數(shù)：0～5%為差，6%～15%為±，16%～25%為+，26%～50%為++，>50%為+++。陽性細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度：差無著色或染色與邁新公司的陽性對照片中陽性細(xì)胞相比比其弱，+黃色，++棕黃色，+++棕色。

四、圖像定量分析 應(yīng)用Nikon Eclipse 50i計算機(jī)圖像分析儀，在400倍鏡下對行MMP-9染色的切片每張隨機(jī)選取3個視野的上皮細(xì)胞和相鄰的細(xì)胞間質(zhì)。因聲帶息肉病理組織學(xué)變化多樣，為增加研究的可比性，在MMP-9的連續(xù)切片中，選取的視野相同。用Nikon Mivnt顯微圖像分析軟件（WindowsXP版），每個視野隨機(jī)圈定3個陽性單位（3個陽性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)），測定這3個陽性單位均值代表該視野的陽性單位均值。用陽性單位均值表示被染色物質(zhì)的多少，陽性單位均值越大，說明物質(zhì)的相對含量越高，即抗原物質(zhì)表達(dá)的水平越高，反之亦然。

結(jié) 果

一、免疫組化觀察結(jié)果 MMP-9在正常聲帶組中，陽性反應(yīng)主要位于炎性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞。不同的標(biāo)本中各種細(xì)胞的表達(dá)可不一樣，常以某一種細(xì)胞的表達(dá)為主，表達(dá)計數(shù)大多為+，強(qiáng)度多為+～++。也表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、橫紋肌和軟骨細(xì)胞見圖1。在聲帶息肉組中，幾乎所有切片上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、炎性細(xì)胞、和血管內(nèi)皮細(xì)胞都明顯表達(dá)MMP-9。在上皮細(xì)胞的表達(dá)：計數(shù)和表達(dá)強(qiáng)度均在+～++之間；在成纖維細(xì)胞的表達(dá)：計數(shù)大多為+～+++，表達(dá)強(qiáng)度大多為++；在炎性細(xì)胞的表達(dá)：計數(shù)多為+～+++，表達(dá)強(qiáng)度大多為++；在血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)：計數(shù)多為+～+++，表達(dá)強(qiáng)度大多為++見圖2-5。

二、統(tǒng)計結(jié)果 正常聲帶和聲帶息肉組間MMP-9陽性單位均值比較有統(tǒng)計學(xué)差異見附表，聲帶息肉組陽性單位均值（42.9661±9.8012）高于正常聲帶組（16.6147±8.4834）。

圖1 MMP-9在正常聲帶組織固有層中的表達(dá)，主要著色于纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞（免疫組化MaxVision TM法，×200）

圖2 MMP-9在聲帶息肉組織中的表達(dá)，主要著色于炎性細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞（免疫組化MaxVisionTM×200）

圖3 MMP-9在聲帶息肉組織中的表達(dá)，主要著色于上皮細(xì)胞和纖維細(xì)胞（免疫組化MaxVisionTM法，×200）

圖4 MMP-9在聲帶息肉組織中的表達(dá)，主要著色于纖維結(jié)締組織和血管壁（免疫組化MaxVisionTM法，×400）

圖5 MMP-9在聲帶息肉組織中的表達(dá)，主要著色于血管內(nèi)皮細(xì)胞（免疫組化MaxVisionTM法，×200）

討 論

本文在光鏡下觀察到，聲帶息肉組中多數(shù)息肉被覆鱗狀上皮不同程度增生，表面可見輕到中度角化或角化過度。部分病例棘細(xì)胞水樣變性。間質(zhì)可見，結(jié)構(gòu)疏松，不同程度水腫，炎性細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管密集、擴(kuò)張、充血，含鐵血黃素沉著，纖維細(xì)胞增生，玻璃樣變性等。以上改變可以某種為主或共同存在。固有層結(jié)締組織排列紊亂，層狀結(jié)構(gòu)消失，可見少量腺體增生。炎性細(xì)胞數(shù)量較正常聲帶組織多。這也說明聲帶息肉的形成過程中存在著炎癥反應(yīng)。

附表 正常聲帶和聲帶息肉MMP-9陽性單位均值比較

已進(jìn)行了大量關(guān)于MMPs在生理和病理情況下組織重塑方面生物學(xué)行為的研究，MMPs能降解細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜和其它蛋白，同時降低細(xì)胞免疫力。Malinsky等[5]研究發(fā)現(xiàn)：MMP-2 and MMP-9在鼻息肉中的表達(dá)顯著高于對照組（中鼻甲）；慢性鼻竇炎合并鼻息肉的患者中，MMP-2 and MMP-9 mRNA基因的表達(dá)顯著高于對照組。Yigit等[6]研究得出結(jié)論：鼻息肉的嚴(yán)重程度主要與MMP-2/TIMP-1 增 加 有 關(guān) ，其 次 是MMP-9/TIMP-1。因此，對于鼻息肉病人，選擇性抑制MMP-2或MMP-9，活化TIMP-1可能是一種新的治療方案。Yeo等[7]研究報告：MMP-9在鼻息肉中的表達(dá)高于對照組（下鼻甲粘膜），在復(fù)發(fā)性鼻息肉中的表達(dá)也顯著高于鼻息肉組，特別是在基質(zhì)中的表達(dá)。由此得出結(jié)論，MMP-9可能與鼻息肉的復(fù)發(fā)有關(guān)。Wang等[8]研究得出結(jié)論：不被TIMP-1抑制的MMP-9 mRNA的顯著上調(diào)，促進(jìn)了經(jīng)呼吸道感染病毒的蛋白水解活動，這可能使慢性鼻竇炎合并鼻息肉患者的病變進(jìn)一步進(jìn)展。國外學(xué)者Karahan等[9]在聲帶息肉的研究中顯示：和正常聲帶相比，MMP-2，MMP-9在聲帶息肉間質(zhì)梭形細(xì)胞和血管壁的表達(dá)顯著增強(qiáng)。在我們的實驗中，MMP-9在正常聲帶和聲帶息肉中均呈程度不一的陽性反應(yīng)。在正常聲帶中，MMP-9陽性反應(yīng)主要位于炎性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞，不同的標(biāo)本中各種細(xì)胞的表達(dá)可不一樣，常以某一種細(xì)胞的表達(dá)為主。幾乎所有聲帶息肉切片上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、炎性細(xì)胞、和血管內(nèi)皮細(xì)胞都明顯表達(dá)MMP-9。聲帶息肉組MMP-9染色較正常聲帶組深，經(jīng)圖像定量分析，正常聲帶和聲帶息肉組間MMP-9陽性單位均值比較均有統(tǒng)計學(xué)差異，聲帶息肉組MMP-9陽性單位均值(42.9661±9.8012)，高于正常聲帶組（16.6147±8.4834）。

［1］LIG,ZHANGY,QIANY,et al.Interleukin-17A promotes rheumatoid arthritis synoviocytes migration and invasion under hypoxia by increasing MMP2 and MMP9 expression through NF-κB/HIF-1α pathway[J].Mol Immunol,2013,53(3):227-236.

［2］MALIAV,WAGH UV,HEGDEMV,et al.In vitro antimetatic activity of enterolactone,a mammalian lignan derived from flax lignan,and down-regulation of matrix metalloproteinases in MCF-7 and MDA MB 231 cell lines[J].Indian JCancer,2012,49(1):181-187.

［3］MISHRA A,SRIVASTAVA A,MITTAL T,et al.Association of matrix metalloproteinases(MMP2,MMP7 and MMP9)genetic variants with left ventricular dysfunction in coronary artery disease patients[J].Clin Chim Acta,2012,413(19-20):1668-1674.

［4］APOSTOLIDOUE,PARASKEVA E,GOURGOULIANISK,et al.Matrix metalloproteinases2 and 9 increase permeability of sheep pleurain vitro[J].BMCPhysiol,2012,12:2.

［5］MALINSKY RR,VALERA FC,CAVALLARIFE,et al．Matrix metalloproteinases and their impact on sinusal extension in chronic rhinosinusitis with nasal polyps[J].Eur Arch Otorhinolaryngol,2013,270(4):1345-1348.

［6］YIGITO,ACIOGLUE,GELISGENR,et al．Theeffect of corticosteroid on metalloproteinase levels of nasal polyposis[J].Laryngoscope,2011,121(3):667-673.

［7］YEONK,EOMDW,OH MY,et al．Expression of matrix metalloproteinase 2 and 9 and tissue inhibitor of metalloproteinase1 in nonrecurrent vsrecurrent nasal polyps[J].Ann Allergy Asthma Immunol,2013,111(3):205-210.

［8］WANGJY,WATANABES,MATSUKURA S,et al．Effects of double-stranded RNA poly(I:C)on matrix metalloproteinase mRNA expression in human nasal polyp epithelial cells[J].Zhonghua Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi,2010,45(3):229-232.

［9］KARAHANN,BASPINARS,YARIKTASM,et al．Matrix Metalloproteinases(MMP-2 and MMP-9)and cyclooxygenase-2(COX-2)expressions in vocal fold polyps[J].J Voice,2009,23(1):29-33.