王川丕，諸 力，劉 新，張穎彬，周蘇娟

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008）

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定茶葉中8 種單、寡糖的含量

王川丕，諸 力，劉 新*，張穎彬，周蘇娟

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008）

建立同時定性和定量分析茶葉中鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、蔗糖和棉子糖8 種單、寡糖的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法。樣品經(jīng)超聲波輔助提取，以Waters Acquity BEH Amide色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）分離，以乙腈-水溶液（各含體積分數(shù)0.1%氨水）為流動相，電噴霧負離子多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測。結(jié)果表明，8 種單、寡糖的定量檢出限為0.01～0.54 mg/L，線性范圍為1.0～200.0 mg/L；添加水平在10.0 mg/L和100.0 mg/L內(nèi)，回收率為80.2%～103.2%。應(yīng)用該方法分析包含綠茶、烏龍茶、普洱茶和紅茶的20 個樣品，發(fā)現(xiàn)大部分樣品中都能檢測到葡萄糖、果糖、蔗糖和棉子糖，它們的含量分別為0.39～17.64、0.53～22.83、2.07～40.70 g/kg和0.57～14.67 g/kg；但在所有樣品中均未檢測到鼠李糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖。

超高效液相色譜-質(zhì)譜；茶葉；葡萄糖；果糖；蔗糖；棉子糖

糖類又稱為碳水化合物，是植物光合作用的初級產(chǎn)物，植物中的絕大多數(shù)成分都是通過糖類合成的，所以糖類不僅是植物的貯藏養(yǎng)料和骨架，還是其他有機物質(zhì)的前體[1]。

糖不僅是茶葉的滋味物質(zhì)[2-3]，給茶湯帶來甘醇的味道，而且在茶葉的制造過程中，可發(fā)生焦糖化作用和羰氨反應(yīng)，生成相應(yīng)的醛類、吡咯類和吡嗪類化合物等[4]，對茶葉的色澤和香氣的形成有重要作用[5-9]；此外研究發(fā)現(xiàn)，單、寡糖具有促進人體腸胃蠕動，改善腸胃功能，抑制茶湯中兒茶素氧化[10]，增強茶湯抗氧化活性[11]的作用。因此，單、寡 糖是茶葉中重要化學(xué)成分，與茶葉的滋味、湯色和香氣及其生理功能密切相關(guān)，因此建立茶葉中單、寡糖的快速準確的檢測方法，對提高茶葉研究水平，控制茶葉產(chǎn)品質(zhì)量具有重要的作用。

茶葉中的游離單、寡糖因含量少、易轉(zhuǎn)化，至今尚未見有系統(tǒng)的檢測分析方法的研究報告，檢測單、寡糖的方法有離子色譜法[12-13]、氣相色譜法[14]、高效液相色譜法[15-19]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[20-23]。離子色譜法配合電化學(xué)檢測器可以分析糖類物質(zhì)，但存在色譜峰寬、分離度差、容易產(chǎn)生嚴重干擾等問題。氣相色譜法需要將糖類物質(zhì)進行衍生，以提高目標化合物的揮發(fā)性，操作步驟多，過程比較繁瑣。由于糖類物質(zhì)無紫外吸收，液相方法常采用蒸發(fā)光散射檢測器或示差檢測器檢測，存在方法檢出限低、排除干擾能力差等缺點。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有操作簡單、靈敏度高、選擇性好、測定周期短等優(yōu)點[24-25]。

本實驗建立超高效液相色譜-質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLCMS）技術(shù)同時測定茶葉中葡萄糖、甘露糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、蔗糖和棉子糖含量的方法，并應(yīng)用該方法對綠茶、烏龍茶、普洱茶和紅茶的20 個實際樣品進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄糖、甘露糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、蔗糖和棉子糖（純度98%～99%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈（色譜純）、氨水（純度25%、優(yōu)級純） 德國默克化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3200型三重四極桿質(zhì)譜 美國AB公司；Acquity超高效液相色譜 美國Waters公司；Mill-Q去離子水發(fā)生器 美國Millipore公司；KQ-5200型超聲波清洗儀昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的制備

1.3.1.1 標準儲備溶液的制備

精確稱取葡萄糖、甘露糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、蔗糖和棉子糖標準品各1.00 g于100 mL容量瓶中，以體積分數(shù)50%乙腈溶液為溶劑，配制成質(zhì)量濃度10.0 mg/mL的混合標準儲備溶液。

1.3.1.2 標準工作溶液的制備

取10.0 mg/mL的標準儲備液添加適量體積分數(shù)50%乙腈溶液稀釋成一系列質(zhì)量濃度（1.0、10.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL）的標準工作溶液。

1.3.2 樣品處理

1.3.2.1 超聲波輔助提取法制備未加標樣品溶液

稱取0.30 g樣品（精確至0.1 mg），置于100 mL容量瓶中，加入25 mL純水，超聲提取15 min，過濾得到濾液，殘渣用25 mL純水重復(fù)提取1 次，合并2 次提取濾液，加入50 mL乙腈后，用純水定容至100 mL。過0.22 μm濾膜，UPLC-MS分析。

1.3.2.2 加熱提取法制備未加標樣品溶液

稱取0.30 g樣品（精確至0.1 mg），置于100 mL容量瓶中，加入25 mL純水，于100 ℃恒溫水浴中提取15 min，過濾得到濾液，殘渣用25 mL純水重復(fù)提取1次，合并2 次提取濾液，加入50 mL乙腈后，用純水定容至100 mL。過0.22 μm濾膜，UPLC-MS分析。

1.3.2.3 加標樣品溶液的制備

取10.0 mg/mL標準儲備液添加適量體積分數(shù)50%乙腈溶液稀釋成質(zhì)量濃度1.0、10.0 mg/mL標準工作溶液。用移液器分別吸取1 mL標準液于樣品中，按1.3.2.2節(jié)未加標樣品溶液的制備步驟同樣處理。

1.3.3 分析條件

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：Acquity BEH Amide（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；流動相：含體積分數(shù)0.1%氨水溶液（流動相A）和含體積分數(shù)0.1%氨水-乙腈溶液（流動相B）；流速0.15 mL/min；進樣量3.0 μL；柱溫35 ℃；運行時間15 min；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table1 Mobile phase gradient

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

表2 8 種糖的監(jiān)測離子對、碰撞氣能量和去簇電壓Table2 Monitoring ion pairs, collision energy and d e clustering potential of 8 saccharides

電噴霧離子（electron spray ionization，ESI）源；離子源溫度250 ℃；掃描方式：負離子模式；霧化氣GS1壓力50 psi；霧化氣GS2壓力50 psi；離子噴霧電壓：－500 V；入 口電壓：－8 V；出口電壓：－4 V。各種糖的質(zhì)譜分析參數(shù)見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的選擇

實驗比較超聲輔助提取法[26]和常規(guī)加熱提取法[27]制備綠茶、烏龍茶、普洱茶和紅茶樣品提取溶液的效果，如表3所示。由表3可以看出，超聲輔助提取法和加熱提取法相比較，提取效果相近，與文獻報道[27]一致，考慮到超聲輔助提取法不需要加熱，操作比較方便、提取時間短、提取效率高、提取液顏色淺，本實驗選擇超聲輔助提取法制備樣品溶液。

表3 提取方法對提取的影響（n=3）Table3 Influence of extraction methods (n=3)

2.2 流動相流速的選擇

實驗參照文獻[26-27]選擇色譜柱Acquity BEH Amide，流動相選擇含體積分數(shù)0.1%氨水溶液（流動相A）和含體積分數(shù)0.1%氨水-乙腈溶液。為了解流動相流速對各種單、寡糖的色譜峰強度、半峰寬和分離度的影響，在0.15、0.20、0.3、0.4 mL/min的流速條件下，進行分離實驗，如圖1～3所示。

圖1 流動相流速對色譜峰強度的影響Fig.1 Effect of flow rate on chromatographic peak intensity

色譜峰強度是目標化合物的靈敏度指標。如圖1所示，隨著流動相流速的降低，各種單、寡糖的色譜峰強度呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，主要原因是在液相色譜-質(zhì)譜中，尤其是使用ESI源時，較低的流速減少同時離子化的化合物數(shù)量，降低待測成分與基質(zhì)成分在電離過程中的競爭，從而減弱基質(zhì)效應(yīng)。

圖2 流動相流速對色譜半峰寬的影響Fig.2 Effect of flow rate on chromatographic peak half width

半峰寬是色譜峰的峰形指標，半峰寬越小，說明色譜峰峰寬越窄，提高流動相流速有利于減少目標化合物在色譜柱上的軸向擴散，有利于改善目標化合物的峰形。如圖2所示，隨著流動相流速的提高，各種糖的色譜峰的半峰寬明顯減小。

圖3 流動相流速對分離度的影響Fig.3 Effect of flow rate on resolution of sugars

分離度（resolution，R）是反映色譜分析方法分離性能的指標，為相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值。由于峰寬難以準確測定，實驗以半峰寬代替峰寬，R越大，表明相鄰兩組份分離越好。一般說當R＜1時，兩峰有部分重疊；當R=1.0時，分離度可達98%；當R=1.5時，R可達99.7%。通常用R=1.5作為相鄰兩組分已完全分離的標志。

實驗計算得各單、寡糖在不同流動相流速條件下的色譜峰R，如圖3所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨流速提高，除蔗糖和棉子糖外，其他糖分離度都呈下降趨勢。由于蔗糖和棉子糖的R一直大于1.5，并非分離的難點，且隨流動相流速提高，色譜峰強度下降明顯，綜合考慮各種糖的靈敏度、峰形和分離度等因素，本實驗選擇0.15 mL/min作為實驗流速。

2.3 色譜柱溫度的選擇

色譜柱的分離溫度對各種單糖的色譜峰強度、半峰寬和峰形有較大的影響，因此，研究不同色譜柱溫度對各種單、寡糖的分離情況，結(jié)果如圖4、5所示。

圖4 色譜柱溫度對色譜峰強度的影響Fig.4 Effect of column temperature on chromatographic peak intensity

由圖4可以看出，隨著色譜柱溫度的升高，單糖物質(zhì)色譜峰強度呈上升趨勢，而棉子糖和蔗糖的色譜峰強度明顯下降，猜測可能是因為這2 種糖分別為雙糖和三糖，在較高的色譜溫度條件下，容易發(fā)生分解。

圖5 色譜柱溫度對半峰寬的影響Fig.5 Effect of column temperature on chromatographic peak half width

由圖5 可知，糖類為多羥基物質(zhì)，具有較高的黏性，提高色譜柱溫度，有利于減少黏性，改善峰形，色譜柱溫度升高，峰形改善，尤其是對單糖效果明顯，但考慮到雙糖和三糖在較高的色譜柱溫度條件下，會產(chǎn)生分解現(xiàn)象，實驗選擇色譜柱溫度35 ℃。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通過針泵進樣，在負離子檢測方式下進行母離子全掃描，得到果糖、葡萄糖、蔗糖和棉子糖等的分子離子。以每種糖的分子離子峰為母離子，進行二級質(zhì)譜掃描，采集全掃描的二級質(zhì)譜圖，得到碎片離子信息，然后再對得到每種糖的二級質(zhì)譜參數(shù)如破碎電壓、碰撞能量等進行優(yōu)化，使每種糖的定性離子與定量離子產(chǎn)生的離子對強度比例達到最大時為最佳，從而得到每種糖的最佳質(zhì)譜參數(shù)（表1）。

糖為熱敏性物質(zhì)，易在高溫條件下產(chǎn)生各種化學(xué)反應(yīng)，本實驗研究不同離子源溫度條件下，色譜峰強度與離子源溫度的關(guān)系，如圖6所示。

圖6 離子源溫度對色譜峰強度的影響Fig.6 Effect of source temperature on chromatographic peak intensity

由圖6可知，隨著離子源溫度的上升，各種單糖的色譜峰強度明顯呈下降趨勢，因此對于分析糖組分，選擇較低的離子源溫度分析效果較好，由于流動相為一定比例的乙腈-水溶液，離子源溫度過低，會造成汽化不完全，色譜峰信噪比降低的現(xiàn)象，所以本實驗選擇離子源溫度為250 ℃。

2.5 總離子流圖

實驗采用1.3.3.1節(jié)色譜條件和1.3.3.2節(jié)質(zhì)譜條件，可以較好地分離茶葉中果糖、葡萄糖、蔗糖和棉子糖等8 種單、寡糖，總離子流圖如圖7所示。

圖7 8 種糖的MRM色譜圖Fig.7 MRM chromatograms of 8 saccharides

2.6 線性范圍與檢出限

表4 8 種糖的工作曲線回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)、檢出限Table4 Linear equation with correlation coefficients, and limits of detection for 8 saccharides

按1.3.1.2節(jié)配制標準工作液分別進樣3 μL，以樣品的色譜峰強度（Y）對質(zhì)量濃度（X，mg/L）進行線性回歸，線性范圍為1.0～200.0 mg/L。按3倍RSN計算定性檢出限，10倍RSN計算定量檢出限（表4）。

2.7 回收率和精密度

每組準確稱取茶葉樣品3 份，每份0.3 g，共3 組，加入8 種糖混合標準樣，添加水平分別為10.0 mg/L和100.0 mg/L，按樣品溶液制備方法制備后進行測定。其回收率和精密度見表5，加標回收率為80.2%～103.2%，相對標準偏差為0.7%～9.2%（n=3）。實驗發(fā)現(xiàn)方法基質(zhì)效應(yīng)較小，可能是因為樣品提取溫度低、樣品溶液中提出物質(zhì)較少所致。

表5 茶樣品中8 種糖的加標回收率（n=3）Table5 Recoveries and precisions for 8 saccharides in tea sample (n=3)

2.8 實際樣品檢測

應(yīng)用本方法對浙江杭州茶葉市場銷售的綠茶、烏龍茶、普洱茶和紅茶4大茶類2 個茶樣品進行了分析測定（表6）。

表6 實際樣品的檢測結(jié)果（n=3）Table6 Analytical results of real samples (n=3)

結(jié)果表明，在所有茶葉樣品中均未檢測到鼠李糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖，在所有茶類中均檢測到葡萄糖、果糖、蔗糖和棉子糖，葡萄糖含量為0.39～17.64 g/kg、果糖含量為0.53～22.83 g/kg、蔗糖含量為2.07～40.70 g/kg，棉子糖含量為0.57～14.67 g/kg。同類型不同茶葉樣品中糖含量的差異懸殊，可能是收集的茶葉樣品的品種不同、制作原料的老嫩度不同和加工工藝多樣化所致。

3 結(jié) 論

實驗表明，本法樣品操作簡單、靈敏度高，明顯提高了檢測效率，適用于快速測定茶葉樣品中 鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、果糖、蔗糖和棉子糖的含量。

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Determination of Eight Saccharides in Teas by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WANG Chuan-pi, ZHU Li, LIU Xin*, ZHANG Ying-bin, ZHOU Su-juan
(Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China)

An ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was develope d for the qualitative and quantitative determination of eight saccharides including rhamnose, xylose, arabinose, fructose, mannose, glucose, sucrose, and raffi nose in teas. Samples were extracted with the assistance of ultrasound. The extract was separated on a Waters Acquity BEH Aminde HPLC column (2.1 mm × 150 mm, 1.7 μm) using acetonitrile-water mixture (each containing 0.1% ammonia) as the mobile phase. The electrospray ionization tandem quadrupole mass spect rometric analysis was carried out in the negative ion mode using multiple reaction monitoring (MRM). The limits of detection were 0.01-0.54 mg/L and the linear ranges were 1.0-200.0 mg/L. The average recoveries were 80.2%-103.2% at spiked levels of 10.0 and 100.0 mg/L. The method was applied to analyze 20 tea samples including green tea, oolong tea, Pu’er tea and black tea. Glucose, fructose, sucrose and raffi nose were detected in most of the samples, and their contents were in the ranges of 0.39-17.64, 0.53-22.83, 2.07-40.70, and 0.57-14.67 g/kg, respectively. However, rhamnose, xylose, arabinose and mannose were not detected in all the samples.

ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; tea; glucose; fructose; sucrose; raffi nose

TS207.3

A

1002-6630（2014）20-0164-06

10.7506/spkx1002-6630-201420033

2014-01-08

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（nycytx-26）

王川丕（1977—），男，助理研究員，碩士，研究方向為茶葉質(zhì)量與安全。E-mail：wangchuanpi@tricaas.com

*通信作者：劉新（1961—），男，研究員，學(xué)士，研究方向為茶葉加工與品質(zhì)檢驗。E-mail：liuxin@tricaas.com