胡祥娜，顧亞萍,*，林慧純，王 瑞，方長發(fā)

（1.深圳市農產品質量安全檢驗檢測中心，廣東 深圳 518040；2.深圳職業(yè)技術學院應用化學與生物技術學院，廣東 深圳 518055）

高效液相色譜串聯(lián)四極桿質譜法同時測定豆芽中7 種藥物殘留

胡祥娜1，顧亞萍1,*，林慧純1，王 瑞1，方長發(fā)2

（1.深圳市農產品質量安全檢驗檢測中心，廣東 深圳 518040；2.深圳職業(yè)技術學院應用化學與生物技術學院，廣東 深圳 518055）

為加強對豆芽類產品的監(jiān)管，研究豆芽中7 種藥物（6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、2,4-D、赤霉素、多菌靈、腐霉利和恩諾沙星）同時檢測的方法。該方法使用乙腈對豆芽中7 種藥物進行同時提取，使用高效液相串聯(lián)四極桿質譜儀對上述7 種藥物進行檢測。7 種藥物在0.01～10 μg/mL（多菌靈和恩諾沙星在0.01～1 μg/mL）內線性良好（R2≥0.987）。兩種豆芽中7 種藥物的3 個添加量（分別為0.002、0.2、0.5 mg/kg）回收實驗結果表明：7 種藥物的回收率為60.31%～108.51%，相對標準偏差為1.03%～13.10%，方法檢出限為0.010 5～0.125 μg/kg。

高效液相色譜串聯(lián)四極桿質譜儀；豆芽；6-芐基腺嘌呤；4-氯苯氧乙酸；2,4-D；赤霉素；多菌靈；腐霉利；恩諾沙星

豆芽類蔬菜為廣大市民經常食用的一類價廉物美的食品，其營養(yǎng)豐富，富含蛋白質、B族維生素和微量元素，且易于被人體消化吸收。但近年來，市場上多次報道毒豆芽、問題豆芽等事件[1-3]。據調查，部分豆芽生產中確實存在濫用藥物的情況，使用藥物有6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉[4]、2,4-D和赤霉素等植物激素[5-7]，多菌靈、腐霉利等殺菌劑農藥和獸藥恩諾沙星[8]等。我國對豆芽中相關藥物的使用有明確的規(guī)定，其中6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉[4]、2,4-D和赤霉素在豆芽生產中使用都屬于違規(guī)行為。恩諾沙星為動物專用藥，也不能將其應用于豆芽的生產中。

目前，豆芽中藥物殘留的檢測方法多為單個化合物一個標準，如6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉和2,4-D[9-11]。而赤霉素、恩諾沙星的檢測還處于研究階段[7]，尚未有標準涵蓋。豆芽中藥物的相關檢測的研究，前處理方法繁瑣[4]，不能滿足快速檢測的要求；實驗多采用高效液相紫外檢測器，導致結果容易受樣品中基質的干擾，影響結果的精確度；方法單一，最多只能同時檢測4 種藥物[7,12-13]。高效液相色譜串聯(lián)四極桿質譜技術在農藥殘留[14]、人工合成甜味劑[15]、工業(yè)染料[16]及中草藥植物成分的測定中已經有研究報道，且均有較穩(wěn)定的回收率及較高的精密度，而使用高效液相串聯(lián)四極桿質譜對上述7 種化合物的檢測研究比較少[6,8,17-19]。

本實驗使用乙腈對6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、2,4-D和赤霉素、多菌靈、腐霉利和恩諾沙星進行同時提取，前處理方法簡單快速。使用高效液相串聯(lián)四極桿質譜儀進行檢測，能最大程度地利用高效液相色譜串聯(lián)四極桿質譜對于基質的抗干擾能力，且方法回收穩(wěn)定，精密度好，更加符合在現有國情下各級監(jiān)測部門對豆芽產品進行快速監(jiān)控的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗豆芽樣品由作者所購綠豆和黃豆經發(fā)芽自制而成。

6-芐基腺嘌呤、恩諾沙星、赤霉素、4-對氯苯氧乙酸和2,4-D標準物質 美國Sigma公司；多菌靈和腐霉利 農業(yè)部環(huán)境質量監(jiān)督檢驗測試中心（天津）；甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國默克公司；氯化鈉（分析純） 西隴化工股份有限公司；無水硫酸鎂、甲酸和乙酸銨（均為優(yōu)級純） 上海安譜科學儀器有限公司；實驗用水為自制超純水。

樣品提取液上機前經0.2 2 μ m的聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）濾膜過濾至2 mL HP小瓶中。

1.2 儀器與設備

XEVO TQ-S高效液相色譜串聯(lián)四極桿質譜聯(lián)用儀（軟件為Masslynx） 美國Waters公司；N-EVAP 112氮吹儀 美國Organomation Associates公司；Elix5純水機美國Millipore公司；T25勻漿機 德國IKA公司；XH-B旋渦混合器 江蘇省姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司；TG16G臺式高速離心機 湖南凱達科學儀器有限公司；AS30600BDT超聲波清洗器 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；濾膜和HP小瓶 安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

標準儲備液：分別準確稱取適量的上述固體標準品（6-芐基腺嘌呤、恩諾沙星、赤霉素、4-對氯苯氧乙酸和2,4-D）用甲醇溶解稀釋配制成質量濃度為1 000 μg/mL的標準儲備液，于－20 ℃條件下保存?zhèn)溆?。多菌靈的標準儲備液質量濃度為500 μg/mL，儲存于室溫備用；腐霉利標準儲備液質量濃度為1 000 μg/mL，儲存于－18 ℃條件下備用。分別準確吸取一定量的上述7 種標準儲備液，混合，用甲醇稀釋成的混合標準溶液，于－18 ℃條件下保存?zhèn)溆?，準確吸取一定量的混合標準溶液，用甲醇和水（體積比為1∶1）溶液稀釋到0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1 μg/mL和10 μg/mL，作為標準工作溶液。

0.2%甲酸溶液：準確移取1 mL甲酸，加水稀釋到500 mL，經超聲波清洗器脫氣5 min用于儀器流動相用。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取經組織搗碎機粉碎的樣品（4±0.05）g，加入12 mL乙腈12 000 r/min勻漿3 min。再加入氯化鈉3 g，勻漿3 min，置于高速離心機中在4 000 r/min離心5 min。靜置15 min后，移出上清液3 mL置于氮吹儀上50 ℃條件下吹干后，加入甲醇和水（體積比為1∶1）定容至1 mL，經0.22 μm的PTFE濾膜過濾至HP小瓶中待上機。

1.3.3 儀器分析條件

1.3.3.1 高效液相色譜條件

Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相：0.2%甲酸溶液-甲醇。流速0.5 mL/min；進樣量1 μL；柱溫40 ℃；流動相梯度如表1所示。

表1 流動相梯度表Table1 Gradient elution program

1.3.3.2 質譜條件

電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）：ESI＋/ ESI－電離模式；毛細管電壓3 kV；干燥氣溫度450 ℃；干燥氣流速900 L/h；錐孔氣流速150 L/h；霧化壓力0.7 MPa；碰撞氣流速0.15 mL/min。

豆芽中7 種添加物的信息如表2所示，其質譜檢測參數詳見表3。

表2 豆芽中7 種添加物信息Table2 Information about seven additives in bean sprouts

表3 豆芽中7 種添加物的質譜檢測參數Table3 MS parameters for seven additives in bean sprouts

2 結果與分析

2.1 質譜條件的選擇

2.1.1 母離子的選擇

取0.5 μg/mL的各化合物標準溶液，依次吸入注射器中，放在蠕動泵進樣器上，設置蠕動泵以20 μL/min的速度進樣，對質譜條件進行優(yōu)化，盡可能得使待測物響應信號達到最高。同時調節(jié)質譜參數（尤其是毛細管電壓、錐孔電壓、干燥氣溫度、干燥氣流速、錐孔氣流速和中性氣體流速），使在該模式下選擇的離子響應值達到最大。

2.1.2 子離子的選擇

使用儀器自帶軟件Intellistart功能對挑選出來的母離子進行碎裂條件的優(yōu)化，為每個母離子自動挑選出2 個子離子并得到最佳碎裂參數（即錐孔電壓、碎裂電壓）。

2.1.3 子離子的再選擇

對上述得到的子離子結合化合物的結構式和碎裂規(guī)律進行再次分析，以驗證儀器自動挑選子離子功能的準確性。終上所述，將7 種化合物的母離子和子離子相關信息匯總如表4所示。

表4 豆芽中7 種添加物質譜檢測條件中母離子、子離子結構信息Table4 Structural information of parent ion and daughter ion for seven additives in bean sprouts

2.2 色譜條件的選擇

比較水、0.2%甲酸溶液和鹽溶液（5 mmol/L乙酸胺和0.05%甲酸）作為流動相時對于7 種化合物的色譜分離的影響。

當使用水-甲醇作為流動相體系時，恩諾沙星的兩個離子響應明顯降低，這可能是因為，后兩種流動相體系中都有一定濃度的酸存在，更加容易誘導恩諾沙星在ESI源中產生[M＋H]＋。當使用鹽溶液-甲醇作為流動相體系時，會容易引起多菌靈和恩諾沙星、4-氯苯氧乙酸和6-芐基腺嘌呤的分離度降低，且個別峰的峰形拖尾，導致化合物之間的干擾嚴重、靈敏度降低。因此綜合考慮，使用甲酸溶液-甲醇作為流動相體系，用于這7 種化合物的分離。

2.3 線性范圍、標準曲線、檢出限

以0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1 μg/mL和10 μg/mL的各類化合物標樣色譜峰面積Y對其質量濃度作圖，得線性回歸方程、相關系數和線性范圍如表5所示。

表5 豆芽中7 種添加物的回歸方相關系數和線性范圍Table5 Regression equations with correlation coefficients and linear ranges

在上述分析條件下，以1.0 μL進樣，對上機最小質量濃度0.01 μg/mL各類化合物進行積分，在各峰附近選擇比較平穩(wěn)的0.2 min左右的檢出作為基線進行信噪比計算，可得到0.01 μg/mL質量濃度條件下，6-芐基腺嘌呤、恩諾殺星、赤霉素、4-氯苯氧乙酸、2,4-D、多菌靈、腐霉利的信噪比分別為190、115、110、203、454、743、230。不考慮樣品基質在檢測條件下對于儀器條件的干擾導致的基線變化情況，以3倍信噪比作為各化合物的檢出限，則6-芐基腺嘌呤、恩諾沙星、赤霉素、4-氯苯氧乙酸、2,4-D、多菌靈、腐霉利最低檢出限分別為0.015 8、0.026 1、0.027 3、0.014 8、0.006 6、0.004 0、0.013 0 μg/kg，完全能滿足日本[20-21]、美國限量標準的檢測需要[22-23]。

按照農藥殘留相關標準的檢測要求[24-25]，以實際能做到的最低檢測質量濃度為檢出限。將上述7 種農藥標準品加入陰性豆芽樣品基質中配制成0.01 μg/mL的溶液，并視峰面積的大小進行逐級稀釋并上機。圖1表明，加入豆芽基質后，會使儀器基線信號有部分放大，導致各類化合物的檢出限會有改變，6-芐基腺嘌呤、恩諾沙星、赤霉素、4-氯苯氧乙酸、2,4-D、多菌靈、腐霉利檢出限分別為0.045 3、0.125、0.052 6、0.032 8、0.028 1、0.010 5、0.039 2 μg/kg。

與其他方法相比，使用液相色譜-質譜進行檢測時，豆芽基質在此7 種化合物的峰附近的干擾很少（黃豆芽基質中無干擾）。這可能是由于選擇二級離子、儀器離子精度高的原因。但是綠豆芽中存在部分化合物的干擾現象，如圖2所示。綠豆芽基質在2,4-D的出峰時間6.82 min處有峰干擾，但是只是其中一組離子有干擾，可以通過更換定量離子來進行定量。而綠豆芽在6-芐基腺嘌呤峰附近（6-芐基腺嘌呤出峰時間為3.74 min，干擾物質出峰時間為3.55 min）有一個小干擾峰，且兩組離子均有相應。但是可以通過設置儀器參數，如調高保留時間控制精度以減少對最終檢測結果的誤判。

圖1 綠豆芽中7 種藥物的提取離子掃描質譜圖Fig.1 Extracted-ion mass spectra of seven additives in mung bean sprouts

圖2 綠豆芽基質的提取離子流圖Fig.2 Extracted-ion current chromatograms of seven additives in mung bean sprouts

2.4 回收率與精密度

采用標準添加法，在空白豆芽基質中添加0.002、0.2、0.5 mg/kg標品進行回收率實驗，每個添加量進行8 個樣品平行實驗，回收率和相關系數結果見表6。結果表明，該方法對7 種藥物的回收率為60.31%～108.51%，精密度（相對標準偏差（relative standard deviation，RSD））在1.03%～13.10%之間。

表6 豆芽中7 種化合物3 種添加量的回收率和精密度（n=6）Table6 Recovery rates and relative standard deviations of seven compounds in spiked bean sprouts (n=6)

2.5 實際樣品分析

從深圳市場和超市隨機抽取30 個豆芽樣品（15 個黃豆芽、15 個綠豆芽）進行7 種藥物的檢測，共3 個樣品4 種藥物10 次檢出，其中多菌靈檢出2 次，最高含量0.10 μg/kg；6-芐基腺嘌呤檢出3 次，最高含量0.052 μg/kg ；2,4-D檢出2 次，最高含量0.087 μg/kg；赤霉素檢出3 次，最高含量0.21 μg/kg。

3 結 論

本實驗使用乙腈對6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、2,4-D、赤霉素、多菌靈、腐霉利和恩諾沙星進行同時快速提取，結合使用高效液相串聯(lián)四極桿質譜儀對7 種非法添加物進行同時檢測。前處理方法簡單快捷，經實驗測算，每次前處理耗時2.5 h，可同時處理樣品12 個左右。使用該方法對黃豆芽和綠豆芽進行3 個添標回收，結果表明7 種化合物的添加回收率穩(wěn)定（60.31%～108.51%），精密度好（RSD為1.03%～13.10%），檢出限低（0.010 5～0.125 μg/kg）。

綜上所述，使用該方法對豆芽進行檢測，更加有利于在我國現有國情下對豆芽產品進行全面快速監(jiān)控，提高監(jiān)控的應急水平，滿足人們對于安全豆芽的食用需求。

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Simultaneous Determination of Seven Drug Residues in Bean Sprouts by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

HU Xiang-na1, GU Ya-ping1,*, LIN Hui-chun1, WANG Rui1, FANG Chang-fa2
(1. Shenzhen Centre of Inspection and Testing for Agricultural Products, Shenzhen 518040, China; 2. School of Applied Chemistry and Biological Technology, Shenzhen Polytechnic, Shenzhen 518055, China)

A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS) method was developed for the simultaneous determination of seven drug residues including 6-benzylaminopurine, para-chlorophenoxyacetic acid, 2,4-D, gibberellin A3, carbendazim, procymidone, and enrofloxacin in bean sprouts. The seven compounds from samples were simultaneously extracted with acetonitrile and analyzed by HPLC-MS-MS. The calibration curves showed good linearity in the range of 0.01-10 μg/mL for 6-benzylaminopurine, para-chlorophenoxyaceti c acid, 10-benzylaminopurine, gibberellin A3, and procymidone, and in the range of 0.01-1 μg/mL for carbendazim and enrofloxacin with correlation coefficients more than or equal to 0.987. The recoveries of these drug residues at three spiked levels (0.002, 0.2 and 0.5 mg/kg) ranged from 60.31% to 108.51%, with relative standard deviation (RSDs) between 1.03% and 13.10% and method detection limit (MDL) between 0.010 5 and 0.125 μg/kg.

high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS); bean sprouts; 6-benzylaminopurine; para-chlorophenoxyacetic acid; 2,4-D; gibberellin A3; carbendazim ; procymidone; enrofloxacin

TS207.3；O657.63

A

1002-6630（2014）20-0253-05

10.7506/spkx1002-6630-201420050

2014-01-15

胡祥娜（1969—），女，高級農藝師，本科，主要從事農產品質量安全監(jiān)測研究。E-mail：huxiangna@163.com

*通信作者：顧亞萍（1982—），女，工程師，碩士，主要從事農產品安全分析檢測研究。E-mail：gypfcf@qq.com