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(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266003 1 附屬醫(yī)院婦科； 2 病原生物學(xué)教研室)

宮頸癌是女性最常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來發(fā)病呈上升趨勢(shì)，且病人逐漸年輕化。轉(zhuǎn)移是影響宮頸癌預(yù)后的重要因素。Raf激酶抑制蛋白(RKIP)是一種高度保守、廣泛表達(dá)的小分子胞漿蛋白，是磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(PEBP)家族成員，在細(xì)胞的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起重要的調(diào)節(jié)作用。近年來的研究結(jié)果顯示，RKIP具有抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用，RKIP在腫瘤治療中的作用已成為腫瘤細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域中的一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。已有研究結(jié)果顯示，RKIP是一種新的前列腺癌轉(zhuǎn)移抑制基因，RKIP在宮頸癌細(xì)胞及其轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中表達(dá)減弱或丟失[1-5]。因此推測(cè)RKIP基因可能在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將含有正義(ss)RKIP cDNA 的真核表達(dá)載體導(dǎo)入宮頸癌Caski細(xì)胞，建立RKIP表達(dá)上調(diào)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，觀察RKIP基因?qū)m頸癌細(xì)胞體外增殖、錨定非依賴性生長(zhǎng)和侵襲等生物學(xué)行為的影響，為深入探討RKIP基因在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后中的作用及其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人宮頸癌細(xì)胞Caski細(xì)胞系，本實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)和含有ssRKIP cDNA 的質(zhì)粒，由美國(guó)密歇根大學(xué)EVEN T KELLER 教授惠贈(zèng)。DMEM培養(yǎng)基，購自Thermo scientific 公司；無內(nèi)毒素FBS，購自杭州天杭生物科技公司；Matrigel基質(zhì)膠，購自美國(guó)BD公司；牛血清清蛋白(BSA)，購自美國(guó)Sigma公司；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑，購自美國(guó)Invitrogen公司；G418，購自Amresco公司；羊抗人RKIP，購自美國(guó)Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗羊二抗，購自北京博奧森公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1RKIP基因轉(zhuǎn)染及陽性細(xì)胞的篩選 轉(zhuǎn)染前1 d，將人宮頸癌Caski細(xì)胞以每孔3×105個(gè)接種于6孔培養(yǎng)板， 24 h后達(dá)到90%細(xì)胞融合，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書步驟將pcDNA3.1(+)和 pcDNA3.1(+)-ssRKIP質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到Caski細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，細(xì)胞按照1∶4傳代，用含500 mg/L G418的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,每3 d換液1次。2～3周后挑取G418抗性克隆，200 mg/L G418維持濃度擴(kuò)大培養(yǎng)，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。

1.2.2Westren-blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞RKIP蛋白的表達(dá) 收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min后，以12 000 r/min離心15 min，小心吸取上清即為細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定其蛋白濃度。取30 μg細(xì)胞總蛋白用120 g/L的丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h。然后用封閉液稀釋的一抗室溫孵育2 h(羊抗人RKIP抗體1∶25 000稀釋，鼠抗人內(nèi)參抗體1∶5 000稀釋)；TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min；封閉液稀釋的二抗室溫孵育1 h(辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊或抗鼠抗體1∶1 000稀釋)；用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min；ECL試劑發(fā)光、顯影和定影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果應(yīng)用Quantity One軟件進(jìn)行灰度值分析，以β-actin為內(nèi)參照，以細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后RKIP蛋白與β-actin蛋白灰度值的比值作為RKIP蛋白的相對(duì)表達(dá)含量。

1.2.3MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染細(xì)胞、ssRKIP細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染的Caski細(xì)胞，以2.5×106/L的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸凈培養(yǎng)液后每孔加入100 μL DMSO溶液，輕微震蕩5 min待溶液完全溶解后，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)570 nm處的吸光度值(A值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算出各時(shí)間點(diǎn)的平均值，繪制生長(zhǎng)曲線,分析其增殖能力。

1.2.4雙層軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn) 將12 g/L瓊脂與含體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS的DMEM培養(yǎng)基等體積混合，立即加入6孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，待瓊脂凝固后備用；將6 g/L瓊脂與含有密度2×107/L細(xì)胞及含體積分?jǐn)?shù)0.20 FBS的DMEM培養(yǎng)基等體積混合，使細(xì)胞密度為1×107/L，分別加入到含有底層瓊脂的6孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10～14 d。于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)大于50個(gè)的克隆，計(jì)算克隆形成的平均數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn) 將小室置于4 ℃預(yù)冷后，濾膜底部涂以人工基底膜基質(zhì)凝膠matrigel 25 μL(凝膠用無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋為0.2 g/L),37 ℃環(huán)境下作用30 min，待matrigel膠在微孔濾膜上重組為基底膜結(jié)構(gòu)，PBS沖洗。24孔板內(nèi)加入含1 g/L BSA的DMEM培養(yǎng)液，每孔600 μL。5種細(xì)胞胰酶消化后，用含有1 g/L BSA的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L，小室內(nèi)加入100 μL細(xì)胞懸液后浸入含有1 g/L BSA的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育8～10 h。取出小室，PBS沖洗3次，結(jié)晶紫染色，棉簽拭去膜表面上的細(xì)胞，高倍顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立

經(jīng)過3周的G418(500 mg/L)篩選，成功建立了既上調(diào)表達(dá)RKIP基因又具有G418抗性的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染宮頸癌Caski細(xì)胞(ssRKIP細(xì)胞)，并同時(shí)獲得了空載體pcDNA3.1(+)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞(pcDNA3.1(+)細(xì)胞)。

2.2 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中RKIP基因表達(dá)的比較

與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，ssRKIP細(xì)胞的RKIP蛋白表達(dá)水平上調(diào)，pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染細(xì)胞RKIP蛋白的表達(dá)水平變化不大(圖1)；ssRKIP細(xì)胞RKIP蛋白的相對(duì)表達(dá)含量為2.13，空載體pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染細(xì)胞為1.12,未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為1.08。

2.3 RKIP基因轉(zhuǎn)染前后各組細(xì)胞體外增殖能力的比較

實(shí)驗(yàn)48、60、72 h，空載體pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的體外增殖能力與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞比較差異無顯著性(t=2.13～3.20，P均>0.05)；ssRKIP細(xì)胞的體外增殖能力明顯低于未轉(zhuǎn)染組，差異有顯著意義(t=6.22～7.16，P均<0.01)。見圖2。

①未轉(zhuǎn)染細(xì)胞；②pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染細(xì)胞；③ssRKIP細(xì)胞。

圖2 RKIP基因轉(zhuǎn)染Caski細(xì)胞前后細(xì)胞的體外增殖能力

2.4 RKIP基因轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的錨定非依賴性生長(zhǎng)能力比較

軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞均能在軟瓊脂中形成細(xì)胞集落。ssRKIP組細(xì)胞克隆形成數(shù)為112.78±5.60，未轉(zhuǎn)染組為151.55±6.14，pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染組為159.11±3.64，ssRKIP組與未轉(zhuǎn)染組相比較，差異有顯著意義(t=8.14,P<0.01)；而未轉(zhuǎn)染組與pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.80，P>0.05)。

2.5 RKIP基因轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞體外侵襲能力比較

ssRKIP組穿膜細(xì)胞數(shù)為54.33±4.12，未轉(zhuǎn)染組為80.00±3.20，pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染組為76.00±2.52，ssRKIP組與pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染組比較，差異有顯著性(t=9.24，P<0.01)；pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組比較，差異無顯著性(t=3.26，P>0.05)。

3 討 論

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，轉(zhuǎn)移是影響宮頸癌預(yù)后的重要因素之一。已有研究表明，Ⅰb～Ⅱa期的子宮頸癌病人若無盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其5年生存率可達(dá)85%～90%；而一旦有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其5年生存率則降為30%～60%，即使常規(guī)病理檢查無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等高危因素的病人，仍有10%出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[1-2]。轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的、多步驟的癌細(xì)胞和宿主相互作用的過程。腫瘤細(xì)胞從原初病灶逃逸，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，然后侵襲到一個(gè)遠(yuǎn)離的組織位點(diǎn)，在該靶位點(diǎn)生長(zhǎng)成為一個(gè)肉眼可見的腫瘤。明確惡性腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制，阻斷腫瘤的轉(zhuǎn)移是提高病人生存率、根治腫瘤的希望所在。

RKIP是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。FU等[3-4]研究顯示，RKIP基因在轉(zhuǎn)移的前列腺癌細(xì)胞C4-2B中的表達(dá)明顯低于非轉(zhuǎn)移性的前列腺癌細(xì)胞LNCaP，過量表達(dá)RKIP的前列腺癌細(xì)胞C4-2B的體外侵襲能力減弱，推斷RKIP是一種新的前列腺癌轉(zhuǎn)移抑制基因。隨后，這一推斷在黑色素瘤及乳癌中得到證明[8-11]。近年來有研究結(jié)果顯示，RKIP在正常宮頸組織及宮頸上皮內(nèi)瘤變組織的表達(dá)無明顯差異，而在宮頸癌組織的表達(dá)低于正常宮頸組織及宮頸上皮內(nèi)瘤變組織，在宮頸癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織的陽性表達(dá)率低于宮頸癌組織,推斷RKIP基因在宮頸上皮內(nèi)瘤變向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)變中可能起重要作用，RKIP基因可作為宮頸癌良惡性鑒別診斷的標(biāo)志，可能是宮頸癌的轉(zhuǎn)移抑制基因[5-7]。另有研究顯示，RKIP在高侵襲性宮頸癌細(xì)胞系Caski中的表達(dá)低于其他各組，認(rèn)為RKIP基因與宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力有關(guān)[7]。

為了進(jìn)一步探討RKIP基因在宮頸癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用，本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將含有ssRKIP cDNA 的質(zhì)粒導(dǎo)入宮頸癌Caski細(xì)胞，建立了RKIP基因表達(dá)上調(diào)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，結(jié)果顯示，RKIP基因?qū)m頸癌細(xì)胞體外增殖、錨定非依賴性生長(zhǎng)和侵襲能力等生物學(xué)行為均有明顯的抑制作用。體外增殖實(shí)驗(yàn)及雙層軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， RKIP基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞吸光度值明顯低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，克隆形成數(shù)亦明顯少于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，說明RKIP基因表達(dá)上調(diào)能抑制Caski細(xì)胞的體外增殖和錨定非依賴性生長(zhǎng)能力。該結(jié)果與LI等[12]對(duì)卵巢癌研究結(jié)果一致；但是與FU等[3]和SCHUIERER等[10]的研究結(jié)果不同，他們的結(jié)果顯示，RKIP基因?qū)η傲邢侔┘?xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞的體外增殖、錨定非依賴性生長(zhǎng)能力并無影響。

腫瘤的轉(zhuǎn)移過程涉及多個(gè)步驟和環(huán)節(jié)，其中侵襲是比較重要的環(huán)節(jié)。本研究Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RKIP基因表達(dá)上調(diào)的Caski細(xì)胞的體外侵襲能力減弱，說明RKIP基因能夠抑制宮頸癌Caski細(xì)胞的體外侵襲能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與LI等[12]和FU等[3]研究結(jié)果一致。

本文研究結(jié)果還顯示，上調(diào)表達(dá)RKIP基因后的Caski細(xì)胞的體外增殖、克隆形成數(shù)及穿膜細(xì)胞數(shù)均明顯低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，表明RKIP基因不僅對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移有抑制作用，對(duì)其生長(zhǎng)增殖、錨定非依賴性生長(zhǎng)能力也有抑制作用。鑒于抑制轉(zhuǎn)移過程的基因(稱為轉(zhuǎn)移抑制基因)并不抑制原初腫瘤的生長(zhǎng)，而本文結(jié)果顯示RKIP對(duì)宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及侵襲均有抑制作用，因此我們初步認(rèn)為，RKIP基因可能是宮頸癌的抑癌基因。

隨著RKIP基因在多種腫瘤中轉(zhuǎn)移抑制作用的不斷被發(fā)掘，其在腫瘤基因治療中的潛在價(jià)值也日趨顯現(xiàn)。最新的研究結(jié)果表明，RKIP表達(dá)上調(diào)能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性[13-14]。RKIP表達(dá)下調(diào)與腫瘤的惡性演化具有相關(guān)性，恢復(fù)RKIP表達(dá)能夠改變其惡性侵襲和抗藥性等惡性生物學(xué)行為，這些結(jié)果都將支持RKIP作為一個(gè)重要的抗腫瘤治療靶點(diǎn)，并且已有Raf活性調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于臨床，其治療效果也令人鼓舞[15]。本研究觀察RKIP基因上調(diào)表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，結(jié)果顯示，RKIP基因與宮頸癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力呈負(fù)相關(guān)，為宮頸癌的基因治療提供了方向和依據(jù)。但RKIP基因?qū)τ趯m頸癌細(xì)胞放化療敏感性的作用尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，RKIP基因可能并不是宮頸癌的轉(zhuǎn)移抑制基因而可能是抑癌基因。鑒于RKIP基因上調(diào)表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力具有抑制作用，RKIP基因有可能成為宮頸癌治療的新靶點(diǎn)。

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