魏建波 劉 琴 鐘 瑜 姜 凱 浙江省立同德醫(yī)院 杭州 310012

腎間質(zhì)纖維化是腎臟疾病慢性進(jìn)展直至發(fā)生終末期腎病的重要因素[1]，臨床有應(yīng)用大黃或以大黃為主藥治療腎間質(zhì)纖維化疾病[2-3]，并且取得較好療效。筆者觀察大黃提取物大黃素對(duì)大鼠腎間質(zhì)纖維化防治的干預(yù)作用，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物 Wistar雄性大鼠60只，體質(zhì)量（180±20）g，清潔級(jí)，浙江省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（浙2008-0033）。

1.2 藥物和主要試劑 大黃素，成都茂辰生物科技有限公司生產(chǎn)；I型膠原（C-I）、Ⅲ前膠原肽（PⅢP）、透明質(zhì)酸（HA）ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海瑞奇生物科技有限公司；Trizol試劑盒，購(gòu)自Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 主要儀器 低溫高速離心機(jī)為美國(guó)Beckman Coulter；PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品；凝膠電泳儀為美國(guó)伯樂公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 大鼠造模與給藥 常規(guī)飼養(yǎng)大鼠1周后，將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組、模型組及大黃素小、中、大劑量組各12只。將大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，進(jìn)行氣管插管。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠結(jié)扎左側(cè)輸尿管近腎盂段制備腎間質(zhì)纖維化模型，假手術(shù)對(duì)照組行手術(shù)但不結(jié)扎。次日大黃素各組分別給予大黃素25、50和80mg/kg腹腔注射給藥，1周3次，共4周。假手術(shù)對(duì)照組、模型對(duì)照組用等量生理鹽水代替。

各組動(dòng)物于造模后28天后，眼球取血后處死。大鼠血離心后，取血清-20℃保存?zhèn)溆?；左?cè)腎臟行原位灌流去除血細(xì)胞后，腎組織液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 觀察指標(biāo) ①各組大鼠生存狀況并記錄生存曲線。②血清 C-I、PⅢP、HA含量檢測(cè)：采用ELISA方法檢測(cè)血清中C-I、PⅢP、HA含量。③RT-PCR檢測(cè)大鼠腎組織TGF-βmRNA的表達(dá)：采用Trizol一步法示提取組織總RNA。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法進(jìn)行RT-PCR，mRNA定量采用半定量的RT-PCR法。引物序列如下：TGF-β 上游：5’-gaagtggatccacgagcccaag-3’，下游：5’-gctgcacttgcaggagcgcac-3’，內(nèi)參照GAPDH 上游：5’-tggaatcctgtggcatccatgaaac-3’,下游：5'-acgcagctcagtaacagtccg-3’。PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件為：94℃，30sec；54℃，40sec；72℃，1min；30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，以對(duì)GAPDH相對(duì)值記錄結(jié)果。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 生存曲線 記錄各組大鼠實(shí)驗(yàn)開始至第28天的生存狀況。對(duì)照組大鼠第28天時(shí)存活10只，模型組大鼠第28天僅存活4只，大黃素小劑量組、中劑量組、大劑量組大鼠到第28天時(shí)分別存活6只、7只和8只，較模型組有明顯升高。見圖1。

圖1 各組大鼠生存曲線

3.2 大黃素對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠血清C-I、PⅢP、HA含量影響 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清C-I、PⅢP、HA含量顯著升高（P均＜0.01）；與模型組比較，大黃素各組血清C-I、PⅢP、HA含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），見表1。

3.3 大黃素對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織TGF-βmRNA表達(dá)的影響 腎組織TGF-βmRNA RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。將電泳條帶進(jìn)行凝膠成像比較分析，見圖3，模型組腎組織TGF-βmRNA表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。大黃素各劑量組TGF-βmRNA表達(dá)與模型組比較顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 各組大鼠血清中C-I、PⅢP、HA含量比較（±s） μg/L

表1 各組大鼠血清中C-I、PⅢP、HA含量比較（±s） μg/L

注：與對(duì)照組比較，△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

n/只C-I PⅢP HA 組 別

圖2 腎組織TGF-βmRNA RT-PCR凝膠電泳圖

圖3 大黃素對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織TGF-βmRNA表達(dá)的影響

4 討論

大黃素是從大黃生藥中分離提純的有效成分之一，具有抑菌消炎、抗氧化，以及抗腫瘤、調(diào)節(jié)胃腸活動(dòng)、抗肝腎纖維化等多種藥理作用[4-6]。本實(shí)驗(yàn)采用單側(cè)輸尿管梗阻法制備腎間質(zhì)纖維化模型[7]。腎間質(zhì)纖維化是腎間質(zhì)細(xì)胞增生，腎間質(zhì)膠原過度沉積，最終導(dǎo)致纖維化的過程。

I型膠原（C-I）、Ⅲ前膠原肽（PⅢP）、透明質(zhì)酸（HA）是觀察纖維化過程的重要指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，大黃素能明顯降低大鼠血清HA、C-I和PⅢP水平，說明大黃素有較好的抑制細(xì)胞外基質(zhì)合成，促進(jìn)其降解，減輕腎纖維化作用。大黃素給藥組大鼠最終生存數(shù)量明顯多于模型組，提示大黃素可能具有治療腎纖維化的作用。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β）是公認(rèn)的促纖維化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因子之一，在腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程中起重要作用［8］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腎組織TGF-βmRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，經(jīng)大黃素干預(yù)治療后，TGF-β表達(dá)顯著降低，提示降低TGF-β的表達(dá)量可能是大黃素抗腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制之一。

［1］EddyAA.Molecularbasisofrenal fibrosis［J］.PediatrNephrol，2000，15:290-301.

［2］劉明，何學(xué)紅，李林，等.大黃在慢性腎功衰竭不同階段的應(yīng)用［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2006，24（1）：45-46.

［3］周媧，涂為平，楊麗平，等.大黃對(duì)非尿毒癥慢性腎衰竭患者微炎癥狀態(tài)的影響［J］.南昌大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2012，52（5）：62-66.

［4］嚴(yán)澤軍，程躍，蔣軍輝，等.大黃素通過非Caspase依賴通路誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞BIU87凋亡的機(jī)制［J］.中華泌尿外科雜志，2012，33（4）：259-263.

［5］張文生，李鋒，鮑軍強(qiáng).大黃素對(duì)LoVo細(xì)胞水通道蛋白2表達(dá)的調(diào)節(jié)效應(yīng)［J］.中草藥，2008，39（5）：718-723.

［6］BhadaufiaM ，Shrivastava S，Nirala SK，etaL.Emodin reverses CCL4 induced hepatic cytochrome P450（CYP）enzymatic and ultrastructural changes：The in vivo evidence［J］HepatolRes，2009，39（11）：290-300．

［7］張志新，何立群.腎小管間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型的研究進(jìn)展［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（4）：969-971．

［8］DoiS，Zou Y，Togao O，etaL.Klotho inhibits transferming growth factor-beta1（TGF-betal）signalingand suppresses renal fibrosisand cancermatastasis inmice［J］.JBiolChem，2011,286:8655-8665.