丁凱利，李 娜，張夢曦，李璞玉，李碩果

食管癌是常見的消化道腫瘤之一，目前尚缺乏有效的早期診斷方法，大多數(shù)患者確診時已處于中、晚期，對于不能耐受手術、放療、化療等的病人尚無有效治療措施。光動力療法(photodynamic therapy,PDT)是一種治療食管癌的新技術，PDT的基礎是光敏劑能在腫瘤組織中聚集，關于光敏劑在腫瘤組織聚集的機制尚不完全清楚。本實驗通過高效液相色譜法測定人永生化食管上皮細胞系SHEE及其癌變細胞系SHEEC內photofrin-Ⅱ的濃度，探討腫瘤細胞對光敏劑的親和力度。

1 材料與方法

1.1對象人永生化食管上皮細胞系SHEE及其癌變細胞系SHEEC[1-3](由汕頭大學醫(yī)學院許麗艷教授惠贈)。

1.2主要試劑及儀器光敏劑photofrin-Ⅱ(加拿大Sinclair Pharmaceuticals公司)；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM/F12培養(yǎng)基、PBS液(美國GIBCO公司)；CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司產品)；倒置生物顯微鏡(日本NIKON公司產品)；超凈工作臺(江蘇蘇州凈化設備公司)；80-2型離心機(江蘇常州手術器械廠)；Agilent 1100 系列高效液相色譜儀(美國Agilent公司)。

1.3SHEE及SHEEC的培養(yǎng)、傳代SHEE及SHEEC在含10%小牛血清的DMEM/F12細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)細胞培養(yǎng)、傳代。

1.4實驗分組及處理分別取處于指數(shù)生長期的SHEE及SHEEC，0.25%胰蛋白酶消化，配制成1.0×105個/mL細胞懸液，接種于6孔細胞培養(yǎng)板，每孔1 mL。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將細胞系SHEE及SHEEC分別隨機分成13組，每組3復孔，PBS液沖洗3遍。處理后的13組細胞系SHEE及SHEEC在避光條件下更換為不含胎牛血清的DMEM/F12液配制的光敏劑photofrin-Ⅱ，光敏劑最終濃度分別為0、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120 min后，取出培養(yǎng)板，用PBS沖洗3遍。采用胰蛋白酶消化法消化細胞，每孔加入0.25%的胰蛋白酶0.5 mL，置于7℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中充分消化后置入5 mL離心管中，離心5 min，轉速1 500 r/min，后在冰浴超聲中破碎細胞(功率400 W，作用時間3 s，間隔時間4 s，3次循環(huán))，待細胞破碎后離心，取上清液，加入高效液相色譜儀測定SHEE細胞和SHEEC細胞內光敏劑Photofrin-Ⅱ的含量，探索SHEE和SHEEC細胞對光敏劑Photofrin-Ⅱ不同濃度的吸收規(guī)律。

1.5色譜儀器及條件所有實驗均在室內溫度完成，ZORBAX SB-C18色譜柱，SB-C18保護柱，流動相：乙腈-水-0.1%TFA=45∶35∶20(V/V/V)；流速：1.0 mL/min；柱溫：40℃；檢測波長：400 nm。經(jīng)超聲破碎后的細胞，于高速離心機中離心，12 000 r/min，10 min，吸取上清，0.22 μm孔徑濾膜過濾，準確吸取待測混懸液樣品1.0 mL于10 mL具塞試管中，加入1 mol/L的NaOH 200 μL，充分搖勻。再加入乙酸乙酯3.0 mL，漩渦混合2 min后靜置30 min分層，轉移上層有機相于另一錐底試管中，氮氣流吹干。用200 μL 流動相復溶，取復溶液于自動進樣器的樣品瓶中，設定20 μL進樣檢測。

2 結果

人永生化食管上皮細胞系SHEE及其癌變細胞系SHEEC在濃度分別為0、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL的光敏劑photofrin-Ⅱ孵育5 h，測定細胞內光敏劑photofrin-Ⅱ濃度值，結果見表1。SHEE和SHEEC細胞經(jīng)在含photofrin-Ⅱ的培養(yǎng)液中孵育5 h后對光敏劑photofrin-Ⅱ吸收有差異(t=2.053，P=0.024)，SHEEC比SHEE細胞吸收photofrin-Ⅱ量多。

表1 細胞系SHEE和SHEEC在photofrin-Ⅱ不同濃度下孵育5 h濃度值 μg

3 討論

早期食管癌術后5 a生存率達90%，但一般病人就診已屬于中晚期，能手術治療者僅為20%，術后5 a生存率為30%，晚期放療的5 a生存率不到10%，單用化療效果不佳，說明了食管癌早診斷和早治療的必要性，加強手術與其他治療手段綜合治療研究的必要性。PDT是近30 a新興的治療腫瘤的方法，很多研究發(fā)現(xiàn)光動力對食管癌有獨特的療效。

PDT是指在特定波長光的作用下，使機體內含光敏劑的組織細胞發(fā)生一系列化學生物變化的治療方法。其機理是利用機體攝取光敏劑后一定時期內，光敏劑在腫瘤內形成相對高濃度時，予以一定波長的光照射腫瘤局部，激發(fā)氧分子產生氧化能力極強的活性單態(tài)氧及自由基來破壞腫瘤細胞，達到治療腫瘤的目的。PDT的基礎是腫瘤組織能選擇性攝取光敏劑，病灶部位光敏劑濃度相對正常組織高，而關于光敏劑在腫瘤組織聚集的機制尚不完全清楚，目前大概有腫瘤細胞親和力、血管親和力學說兩種假說。腫瘤細胞親和力學說是指光敏劑能在腫瘤細胞中聚集，Kessel等發(fā)現(xiàn)光敏劑與LDL有獨特親和力，而腫瘤細胞LDL受體上調可能是光敏劑聚集的原因[4]；也可能與腫瘤細胞過度生長導致腫瘤細胞營養(yǎng)不良，缺少卟啉類物質有關。血管親和力學說是由于腫瘤組織新生血管豐富，內皮間隙較大，血管的通透性比較高，光敏劑從內皮間隙大量泄漏，淋巴引流異常，導致光敏劑大量潴留[5]。

本課題組前期試驗通過熒光分光光度儀測定SHEE及SHEEC對photofrin-Ⅱ的吸收排出規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在一定時間內SHEE及SHEEC對photofrin-Ⅱ的吸收排出規(guī)律無明顯差異[6]。但前期研究所采用的熒光分光光度儀法是利用photofrin-Ⅱ的熒光特性，測定SHEE 細胞和SHEEC細胞內光敏劑的熒光強度值，為相對值，并不能完全反映photofrin-Ⅱ的絕對值。本實驗采取的高效液相色譜法，能直接測出photofrin-Ⅱ在SHEE 細胞和SHEEC細胞的絕對含量。

高效液相色譜法是指一種用液體為流動相的色譜分離分析方法，是在經(jīng)典色譜理論的基礎上，采用了高壓泵、化學鍵合固定相高效分離柱、高靈敏專用檢測器等新實驗技術建立的一種液相色譜分析法，已在化學領域、藥學領域、食品分析領域得到了廣泛的應用。目前有關采用高效液相色譜法對卟啉類衍生物的分析分離的報道比較少見。雍政等[7]采用Waters510高效液相色譜儀，PolarlsCl8-A色譜柱，檢測波長為390 nm，以甲醇∶水∶乙腈∶四氫呋喃為流動相，流速為1.5 mL/min，檢測國產血卟啉注射液，發(fā)現(xiàn)該方法快速穩(wěn)定、重復性好，能較好地用于測量該藥物的含量。

本實驗采用Agilent1100系列高效液相色譜儀，ZORBAX SB-C18色譜柱，流動相為乙腈-水-三氟乙酸，流速為1.5 mL/min，能較好地檢測出photofrin-Ⅱ在細胞懸液中的含量。研究結果發(fā)現(xiàn)，細胞系SHEE及SHEEC在photofrin-Ⅱ中孵育5 h，SHEEC吸收Photofrin-Ⅱ的量較SHEE多，提示食管癌細胞系SHEEC對photofrin-Ⅱ有獨特親和力，這為進一步揭示光動力療法的靶向治療原理提供了基礎。

參考文獻：

[1] 沈忠英,岑山,蔡維佳,等.人乳頭狀瘤病毒18型E6E7基因誘導人胚食管上皮永生化[J].中華實驗和臨床病毒學雜志, 1999，13: 121-124.

[2] Shen ZY,Xu LY,Chen XH,et al.The genetic events of HPV-immortalized esophageal epithelium cells[J]. Int J Mol Med,2001,8: 537-524.

[3] 沈忠英,蔡維佳,沈健,等.人乳頭狀瘤病毒18型E6E7和TPA協(xié)同誘發(fā)人胚食管上皮細胞惡性轉化的研究[J].病毒學報,1999,15:1-5.

[4] Kessel D.The role of low-density lipoprotein in the biodistribution of photosensitizing agents[J].Photochem Photobiol B,1992,14:261-262.

[5] Iyer AK,Greish K,Seki T,et al.Polymeric micelles of zinc protoporphyrin for tumor targeted delivery based on EPR effect and singlet oxygen generation[J].Drug Target，2007,15:496-506.

[6] Gao SG,Wang LD,Feng XS,et al.Absorption and elimination of photofrin-II in human immortalization esophageal epithelial cell line SHEE and its malignant transformation cell line SHEEC[J].Ai Zheng,2009,12:1248-1254.

[7] 雍政,何冰,王蕭.國產血卟啉注射液的高效液相色譜質量檢測[J].武警醫(yī)學院學報,2011,20:964-965.