劉大鋒, 袁 彩, 陳靜怡, 陳 卓, 黃明東,

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;2.中國科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所結(jié)構(gòu)化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3.福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002)

人們對抗生素的濫用，導(dǎo)致了耐藥菌的出現(xiàn),特別是“超級細(xì)菌”的出現(xiàn),引起了全球的恐慌,尋找和研發(fā)新的抗菌藥物已迫在眉睫[1,2].光動力抗菌療法(photodynamic antibacterial chemotherapy, PACT)以具有殺菌速度快、多靶標(biāo)性和不易產(chǎn)生耐藥菌等優(yōu)點(diǎn),而成為一種新型的抗菌方法[3,4].PACT以光敏劑(photosensitizer, PS)、光源和氧為基本要素[2,4].在光照下,PS吸收光子能量,并將其傳遞給氧分子,發(fā)生光氧化反應(yīng),通過Ⅰ型和Ⅱ型兩種反應(yīng)機(jī)制而產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)[5-7].活性氧與細(xì)胞生物膜、大分子物質(zhì)(蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等)和各種亞細(xì)胞器等細(xì)胞物質(zhì)發(fā)生反應(yīng),從而引起細(xì)菌壞死或凋亡[4-9].PACT在一些牛皮癬和硬皮病等局部感染區(qū)逐步得到了應(yīng)用,但PACT仍然不是現(xiàn)階段主要的治療手段，抗菌光敏劑的開發(fā)依然如火如荼.

抗菌光敏劑的開發(fā)受制于對光敏劑抗菌機(jī)理的研究,例如光敏劑如何影響菌體表面電荷,損傷菌體壁,被菌體吸附的速度和定量等.對于這些機(jī)理的探索能夠?yàn)楣饷魟┑陌l(fā)展提供指導(dǎo).本研究測定了一種新型光敏劑ZnPc(Lys)5的抗菌機(jī)理,及其分別與過氧化氫(H2O2)和聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽(polyhexamethylene biguanidine hydrochloride, PHMB)的聯(lián)合抗菌效果.試驗(yàn)結(jié)果表明，該光敏劑能中和菌體表面負(fù)電荷而且破壞菌體壁.

1 材料與方法

1.1 材料

菌株:大腸桿菌(ATCC25922)和金黃色葡萄球菌(ATCC6538).

培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基.

試劑:氨芐霉素(碧云天生物技術(shù)公司),卡那霉素(碧云天生物技術(shù)公司),聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽(PHMB, BEPHARM),過氧化氫(H2O2,西隴科學(xué)股份有限公司),流式細(xì)胞儀(BECKMANCOULTER),8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS, Aladdin).

儀器:酶標(biāo)儀(BioTek, USA),24孔LED平面紅光光源(波長660 nm±25 nm,光劑量為2.55 J·cm-2·min-1).

1.2 光敏劑的合成與表征

光敏劑ZnPc(Lys)5的合成、純化和特性表征的方法參考本課題組的文獻(xiàn)[3,10-12].

1.3 細(xì)菌對光敏劑吸附動力學(xué)的測定

使用流式細(xì)胞儀熒光通道(APC-A750-A, ex=638 nm, em=780 nm±60 nm),測定菌體對光敏劑的吸附動力學(xué)曲線[13].分別向大腸桿菌和金黃色葡萄球菌(108CFU·mL-1)液中加入光敏劑(1 μmol·L-1)后,離心、洗滌,重懸稀釋50倍,用FSC-SSC使丟棄率小于2%.再利用SSC-H和APC-A750-A每隔30 s檢測熒光信號1次.所有試驗(yàn)均設(shè)置3個獨(dú)立的平行組.

1.4 抗菌活性的測定

采用試管二倍稀釋法,用LB培養(yǎng)液梯度稀釋光敏劑,測定其抑制細(xì)菌生長時的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)[14-16],分別稀釋為125～0.122 μg·mL-1的一系列梯度濃度.取900 μL含光敏劑的LB培養(yǎng)液,分別加入菌液100 μL(終濃度為2.34×106CFU·mL-1),以不加菌液和無光敏劑為陰性對照組,以加菌液而無光敏劑為陽性對照.在洗滌組,洗去溶液中未被菌體吸附的光敏劑;在未洗滌組,不做洗滌處理.各組均設(shè)置3個平行試驗(yàn),孵育,光照(5 min,12.75 J·cm-2),37 ℃條件下培養(yǎng)16～18 h觀察有無菌體生長.在抗生素抑制細(xì)菌生長的組,方法如上,沒有光照.以能夠完全抑制細(xì)菌生長的最低抑菌光敏劑濃度為MIC.

1.5 生長曲線的測定

分別向生長至對數(shù)期的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌溶液中(終濃度為2.34×106CFU·mL-1)加入不同濃度的光敏劑(終濃度分別為1/8、1/4、1/2和1倍的MIC濃度)，以不加光敏劑的菌液為對照組.各組均設(shè)置3個平行試驗(yàn),孵育,光照(5 min,12.75 J·cm-2),37 ℃和150 r·min-1條件下培養(yǎng)，每隔1 h測定600 nm處光密度(D)值1次,每次取100 μL菌液,連續(xù)測定12 h[10].

1.6 細(xì)菌對光敏劑吸附量的測定

菌液(108CFU·mL-1)經(jīng)PBS洗滌和重懸后,與不同濃度的光敏劑(0.2、0.4、0.8、1.6和3.2 μmol·L-1)孵育后,洗去溶液中未被菌體吸附的光敏劑,于裂解液(0.1 mol·L-1NaOH/1% SDS)中裂解60 min[3,10,11].測定裂解后溶液的熒光值(ex=610 nm, em=680 nm).所有試驗(yàn)都設(shè)置3個獨(dú)立的平行組.以光敏劑完全裂解的已知濃度與熒光值間的關(guān)系制定標(biāo)準(zhǔn)曲線,測定結(jié)果以每個細(xì)菌吸附光敏劑的分子個數(shù)表示.

1.7 電動電位測定

菌液(108CFU·mL-1)經(jīng)1mmol·L-1KNO3(pH 6.2)洗滌和重懸后,與不同濃度的光敏劑(0、2、4、8和12 μmol·L-1)孵育,洗去溶液中未被吸附的光敏劑,得含有光敏劑的菌液1 mL后,即刻在室溫下測定菌體表面的電動電位[17,18],每組試驗(yàn)共有10個平行組.

1.8 細(xì)菌細(xì)胞壁受光敏劑影響的測定

用PBS將生長至對數(shù)期細(xì)菌洗滌,并重懸至D600 nm=0.1～0.3后,與不同濃度光敏劑(0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6和4.0 μmol·L-1)混勻并孵育.對照組、光照組和暗處理組均加入終濃度為5.65 mmol·L-1的熒光探針8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS).在光照組里,光照(5 min, 12.75 J·cm-2)后加入ANS;在暗處理組,加入ANS和光敏劑,而僅無光照;在對照組里,無光照無光敏劑.每組都有3個獨(dú)立的平行試驗(yàn).連續(xù)測定ANS熒光值(ex=380 nm, em=520 nm)至穩(wěn)定.

1.9 單用抗菌劑時最低抑菌濃度的測定

采用試管二倍稀釋法,用LB培養(yǎng)液梯度稀釋抗菌藥物.對于光敏劑分別稀釋為125～0.122 μg·mL-1的系列梯度濃度;對于H2O2分別稀釋為2.6 g·L-1至5.1 μg·mL-1;對于PHMB分別稀釋為125～0.122 μg·mL-1的系列梯度濃度.測定方法同1.4試驗(yàn)部分,以能夠完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為其MIC[14-16,19].

1.10 抗菌劑聯(lián)合抑菌效果的評價

在96微孔板中,采用微量稀釋法測定光敏劑和PHMB對細(xì)菌的聯(lián)合抑菌效果,向微孔中分別依次加入50 μL光敏劑和50 μL PHMB,保持從上至下每一橫行PHMB濃度分別為16 MIC、8 MIC、4 MIC、2 MIC、1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC;從左至右每一縱列光敏劑濃度分別為16 MIC、8 MIC、4 MIC、2 MIC、1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC,向每一微孔中加入菌液100 μL(終濃度為2.34×106CFU·mL-1).以不加菌液、PHMB和光敏劑為陰性對照;以加菌液而不加光敏劑和PHMB為陽性對照,各組試驗(yàn)均重復(fù)5次.混勻,孵育,光照(5 min,12.75 J·cm-2),于37 ℃條件下培養(yǎng)16～18 h觀察結(jié)果,分別檢測光敏劑和PHMB對大腸桿菌或金黃色葡萄球菌的最低聯(lián)合抑菌濃度,以能夠完全抑制細(xì)菌生長的最低聯(lián)合用藥濃度為其聯(lián)合MIC.聯(lián)合抑菌的部分抑菌濃度(fractional inhibitory concentration, FIC)的效果評價:FIC=MIC甲藥聯(lián)用/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)用/MIC乙藥單用.判斷兩抗菌劑聯(lián)合抑菌效果的標(biāo)準(zhǔn)為:FIC≤0.5時,具有協(xié)同作用;0.5

1.11 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)至少有3個平行組,所得數(shù)據(jù)使用mean±SD方法處理,且使用Origin 8.5和Microsoft Excel 2013軟件處理.利用軟件DPS v7.0和SPSS 19.0做差異顯著性分析，P<0.05表示顯著相關(guān)性，P<0.01表示極顯著相關(guān)性.

2 結(jié)果與分析

2.1 ZnPc(Lys)5合成與表征結(jié)果

光敏劑ZnPc(Lys)5分子因有1條五聚賴氨酸鏈(圖1a),而在中性溶液中帶有5個正電荷,利用反相柱C18高效液相色譜純化,由100% MeOH/TFA所篩選,得到高純度的光敏劑(圖1b)[12].在DMSO溶液中,該光敏劑的UV/Vis吸收波普在678 nm處有1條Q帶,而在610 nm處有一條弱帶(圖1c)[3].光敏劑單線態(tài)氧的量子產(chǎn)率值為0.63±0.02[12].

a：分子結(jié)構(gòu)；b：在C18 HPLC反向柱中純化(純度>95%)；c：1 μmol·L-1 ZnPc(Lys)5在DMSO溶液中的UV/Vis吸收波普.圖1 ZnPc(Lys)5的表征Fig.1 Characteristics of ZnPc(Lys)5

2.2 細(xì)菌對光敏劑吸附動力學(xué)結(jié)果

P<0.01具有極顯著相關(guān)性.圖2 細(xì)菌對光敏劑ZnPc(Lys)5的吸附動力學(xué)曲線Fig.2 Binding kinetics of ZnPc(Lys)5 on bacteria

由細(xì)菌對ZnPc(Lys)5的吸附動力學(xué)曲線(圖2)發(fā)現(xiàn):大腸桿菌在第3 min時即可達(dá)到對光敏劑的飽和吸附,而金黃色葡萄球菌卻在第5.5 min達(dá)到對光敏劑的飽和吸附(圖2).因此,與金黃色葡萄球菌相比,大腸桿菌對該光敏劑的吸附速率更快.在以下試驗(yàn)中,ZnPc(Lys)5與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的孵育時間分別是3.0和5.5 min,以達(dá)到對該光敏劑的飽和吸附效果.

2.3 抗菌活性結(jié)果

通過對光敏劑抑制菌體生長時MIC值的測定,來檢測光敏劑抗菌活力的大小.向菌液中加入不同濃度的光敏劑,孵育,在洗滌組,洗去未被菌體吸附中的光敏劑;在非洗滌組,保留未被吸附的光敏劑.經(jīng)光照后,溫育培養(yǎng).在洗滌組中,光敏劑抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長的MIC值分別為25.31和6.33 μmol·L-1,在非洗滌組,MIC值分別為1.58和0.79 μmol·L-1.而對于抗生素抑制細(xì)菌生長組,氨芐霉素抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長時的MIC值分別為7.57和484.65 μmol·L-1,卡那霉素對金黃色葡萄球菌和金大腸桿菌生長抑制的MIC值分別為201.13和201.13 μmol·L-1.結(jié)果表明,與抗生素相比,光敏劑對細(xì)菌生長時的抑制能力更強(qiáng).此外,與未洗滌組相比,洗滌組光敏劑抑制細(xì)菌生長時的MIC值明顯增大,其原因可能是:(1)溶液中的光敏劑而后又被吸附到菌體表面;(2)活性氧在菌體表面破壞而產(chǎn)生一些孔洞,被菌體吸附或未被菌體吸附的光敏劑通過這些空洞進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部,造成對細(xì)菌更大的損傷作用.

2.4 生長曲線測定的結(jié)果

測定沒有光敏劑和含有不同濃度光敏劑菌液的D600 nm值,比較細(xì)菌的生長曲線.向菌液中加入不同濃度的光敏劑,孵育,光照,每隔1 h取100 μL菌液測定.結(jié)果顯示:抑制細(xì)菌的生長曲線具有光敏劑的濃度依賴性(圖3).對于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌,在相同的時間時,隨著光敏劑濃度的增加(從0至1倍的MIC),測得的D600 nm值減小.并且與光敏劑濃度1/8 MIC和1/4 MIC、1/4 MIC和1/2 MIC的D600 nm之間的差值相比較，沒有光敏劑和光敏劑濃度1/8 MIC、濃度1/2 MIC和MIC時的差值更大,表明光敏劑五聚賴氨酸酞菁鋅具有理想的抗菌效果.

a：金黃色葡萄球菌;b：大腸桿菌.P<0.01具有極顯著相關(guān)性.圖3 不同濃度光敏劑處理時細(xì)菌的生長曲線Fig.3 S.aureus (a) and E.coli (b) growth curve at different concentrations of PS

2.5 不同細(xì)菌對光敏劑的吸附量

P<0.05具有顯著相關(guān)性.圖4 細(xì)菌對ZnPc(Lys)5的吸附Fig.4 Adsorption of ZnPc (Lys) 5 by bacteria

P<0.05具有顯著相關(guān)性.圖5 ZnPc(Lys)5在洗滌之后對菌體表面電動電位的影響Fig.5 ZnPc (Lys)5 influence on the electric potential of the bacteria after washing

向菌液中加入不同濃度光敏劑,溫育,洗滌,裂解于0.1 mol·L-1NaOH/1% SDS中60 min后,測定每個細(xì)菌吸附光敏劑分子數(shù).試驗(yàn)結(jié)果顯示:隨著光敏劑濃度從0.20 μmol·L-1增加到3.16 μmol·L-1,每個細(xì)菌所吸附的光敏劑數(shù)量也逐步增加(圖4).每個金黃色葡萄球菌所吸附的光敏劑分子數(shù)從(0.64±0.05)×105個升至(8.66±0.44)×105個;而對于大腸桿菌,光敏劑的分子數(shù)則從(0.41±0.05)×105個升至(5.36±0.21)×105個.試驗(yàn)結(jié)果表明:在光敏劑濃度相同時,對于每個細(xì)菌而言,金黃色葡萄球菌吸附的光敏劑分子數(shù)量比大腸桿菌的多.可能因?yàn)?與大腸桿菌表面的脂多糖相比,金黃色葡萄球菌表面的磷壁酸具有更多的負(fù)電荷數(shù)量,從而能夠吸附更多帶有正電荷的光敏劑分子.試驗(yàn)結(jié)果與光敏劑抗菌活性的測定結(jié)果相符合,也與陳卓等的試驗(yàn)結(jié)果(每個金黃色葡萄球菌吸附大約105個光敏劑分子)相一致[3].

2.6 光敏劑增加細(xì)菌表面正電荷

在中性溶液中,菌體表面帶有負(fù)電荷,而1個ZnPc(Lys)5分子則帶有5個正電荷,因此可以通過靜電作用而被吸附到菌體表面.菌液(108CFU·mL-1)與不同濃度光敏劑混勻,孵育,洗滌,測定菌液的電動電位.結(jié)果顯示:沒有加入光敏劑時,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表面的電荷量分別為(-32.93±1.02)和(-28.3±0.51) mV;隨著光敏劑濃度的增加,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表面的電荷數(shù)也逐步增大(圖5).因而,結(jié)果表明，光敏劑能有效地中和菌體表面的負(fù)電荷數(shù),此結(jié)果與細(xì)菌對光敏劑吸附量的試驗(yàn)結(jié)果相吻合.

2.7 光敏劑對菌體細(xì)胞壁的影響

借助熒光探針8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)測定菌體壁的受損程度.ANS的熒光在水溶液中被猝滅,而在疏水環(huán)境中則表現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度(ex=380 nm, em=520 nm).當(dāng)菌體的細(xì)胞壁受損后,熒光探針ANS會進(jìn)入細(xì)胞膜磷脂雙分子層的疏水環(huán)境中,而表現(xiàn)出熒光增大的現(xiàn)象.向菌液中加入不同濃度的光敏劑后,再加入ANS熒光探針,孵育.在光照組,需要光照后,再加入ANS,以避免其被活性氧所破壞而導(dǎo)致熒光降低.通過熒光值的測定,試驗(yàn)結(jié)果表明:隨著PS濃度從0.40至4.00 μmol·L-1的升高,在光照組的熒光值也逐步增大.對于金黃色葡萄球菌,熒光值從1 173 a.u.±23 a.u.逐步升高到2 279 a.u.±31 a.u.;而對于大腸桿菌,熒光值則由1554 a.u.±35 a.u.升高到2587 a.u.±67 a.u.(圖6).研究結(jié)果顯示隨著光敏劑濃度的增加,細(xì)菌細(xì)胞壁的受損程度也增加.

P<0.01具有極顯著相關(guān)性.圖6 在光照時，ZnPc(Lys)5對金黃色葡萄球菌(a)和大腸桿菌(b)細(xì)胞壁的影響Fig.6 Effect of ZnPc (Lys)5 on the cell wall of S.aureus (a) and E.coli (b) during illumination

2.8 抗菌劑單用測定結(jié)果

在抗菌劑單用時,H2O2和PHMB抑制大腸桿菌生長的MIC值分別為41.07 和7.81 μg·mL-1;抑制金黃色葡萄球菌生長的MIC值分別為20.54和7.80 μg·mL-1.與陽性菌株(金黃色葡萄球菌)相比,陰性菌株(大腸桿菌)具有由肽聚糖組成的外膜,而此外膜可減少抗菌藥物對細(xì)菌的傷害.因此,大腸桿菌比金黃色葡萄球菌對抗菌劑表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐藥性.

2.9 抗菌劑聯(lián)合抑菌測定結(jié)果

因?yàn)閆nPc(Lys)5帶有正電荷,且是借助ROS達(dá)到殺菌目的,所以評價光敏劑分別與H2O2和PHMB的聯(lián)合抗菌效果,以確定活性氧或正電荷在PS抗菌中的分別作用.測得光敏劑分別與H2O2或PHMB的聯(lián)合抗菌作用結(jié)果(表1),發(fā)現(xiàn)光敏劑和PHMB對大腸桿菌的最低聯(lián)合抑菌濃度分別是0.98和3.91 μg·mL-1,對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別是0.24和1.95 μg·mL-1(表1).從而可知,對于大腸桿菌,1≤FIC=1<2,光敏劑和PHMB表現(xiàn)出相加抗菌作用;對于金黃色葡萄球菌,FIC=0.5≤0.5,光敏劑和PHMB表現(xiàn)出協(xié)同抗菌作用.結(jié)果表明正電荷的引入沒有促進(jìn)光敏劑對大腸桿菌的抑制作用,卻促進(jìn)了對金黃色葡萄球菌的抑制作用.

表1 藥物最低聯(lián)合抑菌濃度Table 1 Minimum combined bacteriostasis of the drugs μg·mL-1

同理可知,對于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌,光敏劑和H2O2均表現(xiàn)出協(xié)同抗菌作用,因而H2O2能夠增強(qiáng)光敏劑對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制生長作用.

3 討論

本研究表明，隨著光敏劑濃度的增加,菌體對光敏劑的吸附量增大,菌體表面的電動電位也增大,從而對菌體壁的破壞程度也逐步增加.通過對聯(lián)合抗菌效果的評價,H2O2與光敏劑具有協(xié)同抗菌作用;PHMB和光敏劑金黃色葡萄球菌具有協(xié)同抗菌效果,而對大腸桿菌具有相加抗菌效果.

在ZnPc(Lys)5的殺菌過程中,通過靜電作用被吸附到菌體表面.光敏劑經(jīng)光照后產(chǎn)生ROS,在細(xì)菌表面破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,可能會破壞菌體表面而形成一些孔洞;此外,光敏劑也可能穿過這些孔洞,進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部,從而增強(qiáng)了對細(xì)菌的滅活作用.

根據(jù)文獻(xiàn)報道PHMB因富含正電荷而具有高度表面活性作用,易通過靜電吸附作用而粘附于帶有負(fù)電荷的細(xì)菌表面,損傷細(xì)菌細(xì)胞膜,改變細(xì)菌滲透性,最終使細(xì)菌破裂而死亡.在PHMB和ZnPc(Lys)5的聯(lián)合抑菌中,對大腸桿菌具有相加抗菌作用,而對金黃色葡萄球菌具有協(xié)同抗菌作用.因生物膜具有流動性,所以大腸桿菌的外膜的可能會使ZnPc(Lys)5分子快速地進(jìn)入或者通過外膜,與PHMB不能相互影響抗菌效果,使ZnPc(Lys)5和PHMB相互獨(dú)立地發(fā)揮抑菌作用[21,22],從而表現(xiàn)出對大腸桿菌的相加抗菌效果.金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁較厚(15～80 nm)[23],使得ZnPc(Lys)5和PHMB可能都聚集在菌體表面[24],發(fā)揮協(xié)同的抗菌作用[20-22].