孟春，吳正鈞，郭本恒，韓瑨

1(光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海，200436)2(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海，201306)

單胺氧化酶(MAO;EC 1.4.3.4)作為一種主要分布于線粒體外膜的黃素蛋白酶，在人體中能夠?qū)?nèi)源性和外源性胺類物質(zhì)氧化脫氨產(chǎn)生醛類和水［1］，按照對(duì)底物和抑制劑的特異性及分布位置不同，MAO可分為MAO A和MAO B兩種亞型。一些報(bào)道稱抑郁癥、帕金森病和阿爾茨海默病等疾病與MAO在體內(nèi)含量或活性過(guò)高有關(guān)，能夠抑制酶活性的MAO抑制劑(MAOIs)可以作為二線藥物來(lái)治療此類精神疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。MAOIs治療憂郁癥具有一定的優(yōu)勢(shì)，具有持久并且緩和的特點(diǎn)，不容易從興奮轉(zhuǎn)變成抑制作用，這與其他的中樞興奮劑有所不同［2］。

目前天然的MAOIs主要是從不同的植物中提取得到，比如胡椒屬的蓽拔［3］、烏蘞莓屬的烏蘞莓［4］、龍膽屬的黃龍膽［5］和薄荷屬的水薄荷［6］等一些植物，天然MAOIs可以推動(dòng)合成藥物的發(fā)展。對(duì)乳酸菌發(fā)酵液的MAO抑制作用的報(bào)道比較少，Shen［7］等從廣西長(zhǎng)壽之鄉(xiāng)巴馬的健康百歲老人糞便中分離出1株雙歧桿菌，并研究這株乳酸菌的MRS發(fā)酵上清液、菌體和無(wú)細(xì)胞抽提液的抗氧化活性，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)老齡小鼠進(jìn)行灌胃，其中一個(gè)指標(biāo)測(cè)定大腦中MAO的活性，發(fā)現(xiàn)MRS發(fā)酵上清液、菌體和無(wú)細(xì)胞抽提液均能有效降低MAO的活性。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)乳酸菌抑制MAO活性的研究也有一定的成果，第一階段［8］從健康人體糞便中分離出1株干酪乳酸菌JH23，其MRS發(fā)酵上清液對(duì)MAO具有較高的抑制率，確定具有MAO抑制作用的是小分子物質(zhì)。第二階段［9］從干酪乳桿菌JH23的MRS發(fā)酵液中分離純化出具有MAO抑制作用的物質(zhì)琥珀酸。由于干酪乳桿菌JH23在脫脂乳中生長(zhǎng)緩慢，24h無(wú)凝乳現(xiàn)象，脫脂乳發(fā)酵液幾乎無(wú)MAO抑制作用，所以選定幾株實(shí)驗(yàn)室保藏的24h內(nèi)能夠在脫脂乳中凝乳的乳酸菌，對(duì)其發(fā)酵液的MAO抑制作用進(jìn)行比較，最后選擇一株具有優(yōu)勢(shì)的鼠李糖乳桿菌KF7(Lactobacillus rhamnosus KF7)作為目的菌株。

本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design Expert8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析，確定最佳發(fā)酵條件，得到具有較高M(jìn)AO抑制作用的鼠李糖乳桿菌KF7的發(fā)酵液。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌KF7(Lactobacillus rhamnosus KF7)等菌種，實(shí)驗(yàn)室保藏;單胺氧化酶(MAO)，實(shí)驗(yàn)室自制;犬脲胺(Kynuramine dihydrobromide)，Sigma公司;脫脂乳粉，光明新西蘭奶粉廠;KH2PO4，分析純;K2HPO4:分析純;其他試劑均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)分析純化學(xué)試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

TH-CB-402超凈工作臺(tái):LABCONCO公司;HVE-50高壓蒸汽殺菌鍋，日本HIRAYAMA公司;Bug Box厭氧培養(yǎng)箱，RUSKINN公司;GNP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;MDF-U超低溫冰箱，日本 SANYO公司;Spectra M5酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司;AVANTI J30I高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)BECKMAN COULTER公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 單胺氧化酶的制備及單胺氧化酶抑制劑活性的測(cè)定

單胺氧化酶粗酶的實(shí)驗(yàn)室制備根據(jù)Stafford［10］等的方法，從Wistar雄性老年大鼠的肝組織勻漿中采用差速離心法在低溫條件下分離獲得，得到的粗酶液低溫保存。

MAO 活性的測(cè)定［11－13］:以犬脲胺為底物，在 96孔板中分別加入120 μL磷酸鉀緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.4 ～7.6)，30 μL 待測(cè)樣品，20 μL 粗酶液和30 μL的犬脲胺底物(1 mmol/L)，混勻。反應(yīng)體系在37℃反應(yīng)60 min，在波長(zhǎng)360 nm下測(cè)得初始吸光值(I1)和反應(yīng)結(jié)束后的吸收值(I2)，空白對(duì)照用水替代待測(cè)樣品(△I0)。

1.3.2 種子液及發(fā)酵液制備

將脫脂乳凍存的菌種通過(guò)劃線法在MRS瓊脂上活化，在37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，待菌落長(zhǎng)到一定大小后取出，用相同方法再活化一代備用。挑取新鮮培養(yǎng)的菌落接種于5 mL濃度為10%的脫脂乳中，37℃培養(yǎng)24 h左右作為種子液。

將種子液按一定量接種于100 mL濃度為10%的脫脂乳中，在指定溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間取出。將經(jīng)過(guò)發(fā)酵后的脫脂乳以9 000 r/min離心20 min，取上清液，作為待測(cè)樣品，存儲(chǔ)于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.4.1 接種量對(duì)Lb.rhamnosus KF7產(chǎn)MAO抑制劑的影響

分別按1%、2%、3%、4%、5%的比例將新鮮種子液接種到10%(w/w)脫脂乳中，37℃培養(yǎng)48 h取出，測(cè)定發(fā)酵液上清對(duì)MAO的抑制率。

1.4.2 培養(yǎng)溫度對(duì)Lb.rhamnosus KF7產(chǎn)MAO抑制劑的影響

將新鮮種子液按4%的比例接種到濃度為10%(w/w)脫脂乳中，分別在 28、31、34、37、40 ℃5 個(gè)不同溫度培養(yǎng)48 h后取出，測(cè)定發(fā)酵液上清液對(duì)MAO的抑制率。

1.4.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)Lb.rhamnosus KF7產(chǎn)MAO抑制劑的影響

將新鮮種子液按4%的接種量接種到濃度為10%(w/w)的脫脂乳中，在37℃分別培養(yǎng)12、24、48、72、96、120 h后取出，測(cè)定發(fā)酵液上清對(duì) MAO 的抑制率。

1.4.4 脫脂乳濃度對(duì)Lb.rhamnosus KF7產(chǎn)MAO抑制劑的影響

以4%的接種量將新鮮種子液分別接種到4%、6%、8%、10%、12%(w/w)的脫脂乳中，在37℃培養(yǎng)48 h后取出，測(cè)定發(fā)酵液上清對(duì)MAO的抑制率。

1.5 響應(yīng)面法優(yōu)化Lb.rhamnosus KF7產(chǎn)MAO抑制劑的發(fā)酵條件

采用Design Expert8.0軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取接種量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間3個(gè)因素，分別用A、B和C進(jìn)行編碼，選取的3個(gè)水平用－1、0、1編碼，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平表Table 1 The range of independent variables and their corresponding levels

2 結(jié)果與分析

2.1 幾株乳酸菌的脫脂乳發(fā)酵液對(duì)MAO的抑制作用

選取1株干酪乳桿菌(LC2w)、1株鼠李糖乳桿菌(KF7)、1株嗜酸乳桿菌(Lb.acidophilus)、1株乳酸乳球菌(Lc.lactis)、1株瑞士乳桿菌(Lb.helveticus)和1株保加利亞乳桿菌(LB340)，在MRS平板上活化后，以4%接種量接種到10%的脫脂乳中，培養(yǎng)48 h，取上清液，分別測(cè)定上清液和空白10%脫脂乳的MAO抑制作用，結(jié)果如圖1?？梢钥闯鯧F7相對(duì)于其他菌株具有更高的MAO抑制作用，抑制率為(59.75±1.61)%，因而選擇KF7作為目的菌株進(jìn)一步研究。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 接種量對(duì)MAO抑制率的影響

圖1 幾株乳酸菌發(fā)酵脫脂乳上清液和空白脫脂乳對(duì)MAO的抑制作用Fig.1 MAO inhibitory effect of fermented skim milk supernatant by the tested strains and blank skim milk

接種量對(duì)于微生物的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的積累具有一定的影響。將Lb.rhamnosus KF7按不同比例接種到10%(w/w)脫脂乳中，在37℃下培養(yǎng)48 h后，發(fā)酵脫脂乳對(duì)MAO的抑制作用如圖2所示。當(dāng)接種量較小時(shí)，發(fā)酵脫脂乳對(duì)MAO的抑制作用隨著接種量的增加而提高，當(dāng)接種量為3%時(shí)，發(fā)酵液對(duì)MAO的抑制率達(dá)到最高;之后，隨接種量的繼續(xù)增加，抑制率出現(xiàn)小幅下降。可能是發(fā)酵體系中活菌數(shù)量的大量增多，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的快速消耗，同時(shí)乳酸等不利于菌體生長(zhǎng)的有害代謝產(chǎn)物積累過(guò)快等因素，影響對(duì)MAO具有抑制作用的代謝產(chǎn)物形成和積累。

圖2 接種量對(duì)MAO抑制率的影響Fig.2 Effect of inoculum ration on inhibition of MAO by Lb.rhamnosus KF7 fermented skim milk

2.2.2 培養(yǎng)溫度對(duì)MAO抑制率的影響

培養(yǎng)溫度是影響菌體生長(zhǎng)的重要因素之一，適合的溫度有利于菌體的生長(zhǎng)，菌體代謝活躍，促使代謝產(chǎn)物生成。培養(yǎng)溫度對(duì)Lb.rhamnosus KF-7在脫脂乳中發(fā)酵液抑制MAO活性的影響如圖3，溫度在28～34℃之間時(shí)，隨溫度的升高，發(fā)酵液對(duì)MAO的抑制率逐漸升高，在34℃達(dá)到最高，當(dāng)溫度再繼續(xù)升高時(shí)，抑制率則會(huì)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。產(chǎn)生這種趨勢(shì)的可能原因是溫度低于或高于34℃時(shí)，菌體生長(zhǎng)緩慢，因而菌體代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生量相對(duì)菌體的較適生長(zhǎng)溫度條件下的量會(huì)少。

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)MAO抑制率的影響Fig.3 Effect of culture temperature on inhibition of MAO by Lb.rhamnosus KF7 fermented skim milk

2.2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)MAO抑制率的影響

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)微生物積累代謝產(chǎn)物具有重要的影響，按照4%的接種量在37℃培養(yǎng)，隨時(shí)間變化發(fā)酵液對(duì)MAO抑制率的影響。從圖4可以得出，在72 h時(shí)發(fā)酵液對(duì)MAO的抑制率較高。隨時(shí)間增加抑制率逐漸降低，可能是對(duì)MAO具有抑制作用的有效物質(zhì)發(fā)生降解。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)MAO抑制率的影響Fig.4 Effect of culture time on inhibition of MAO by Lb.rhamnosus KF7 fermented skim milk

2.2.4 脫脂乳濃度對(duì)MAO抑制率的影響

脫脂乳濃度也是影響菌體生長(zhǎng)的一個(gè)因素，為菌體生長(zhǎng)提供碳源、氮源等生長(zhǎng)所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從圖5可以看出脫脂乳濃度為12%時(shí)，抑制率最高，與濃度為10%時(shí)的抑制率接近，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，為降低成本，選擇10%濃度的脫脂乳。

2.3 響應(yīng)面分析優(yōu)化鼠李糖乳桿菌KF7產(chǎn)單胺氧化酶抑制劑的培養(yǎng)條件

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

通過(guò)Design Expert8.0軟件的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇接種量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間作為3個(gè)因素，進(jìn)行3因素3水平設(shè)計(jì)，見(jiàn)表2。

圖5 脫脂乳濃度對(duì)MAO抑制率的影響Fig.5 Effect of concentration of skim milk on inhibition of MAO by Lb.rhamnosus KF7 fermented skim milk

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2 Experimental design and result of Response surface analysis

2.3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析及各因素顯著性分析

由表3方差分析可知該模型具有極高的顯著性(Pmodel＜0.0001)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)選用的二次多項(xiàng)模型是可靠的，其決定系數(shù)(R2)=0.982 4，表明發(fā)酵液上清對(duì)MAO抑制率的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值擬合較好。校正決定系數(shù)(R2Adj)=0.959 8，表明該模型能較好地解釋不同條件下發(fā)酵液上清對(duì)MAO抑制率的變化。另外，失擬項(xiàng)不顯著，因此可以用該模型得到的二次回歸方程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析［14］。

對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)回歸擬合，得到發(fā)酵上清液的MAO抑制率對(duì)編碼自變量的二次多項(xiàng)回歸方程:

抑制率(%)=71.83+0.44A+2.06B+0.93C－0.13AB+1.23AC－2.39BC－0.90A2－3.73B2－3.61C2

另外，從表3可知，一次項(xiàng)B、C對(duì)抑制率分別具有極顯著性影響，A影響不顯著，交互項(xiàng)AB影響不顯著，AC影響顯著，BC影響極為顯著，A2影響顯著，B2、C2影響極顯著。說(shuō)明響應(yīng)值是受各因素交互影響的，而不是僅僅某一因素的影響。

表3 響應(yīng)面回歸方程的方差分析Table 3 The analysis of variance for the polynomial model

2.3.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面分析得到的三維曲面圖和等高線圖可以直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響及各參數(shù)之間的相互作用，從響應(yīng)曲面的最高點(diǎn)和等高線可以看出在所選的范圍內(nèi)存在極值。如圖6所示，隨接種量和培養(yǎng)溫度的增大，抑制率是逐漸增大的，達(dá)到某一個(gè)值后，隨2個(gè)自變量的增大，抑制率則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。圖7和圖8顯示，抑制率隨2個(gè)自變量的變化同圖6具有相同的趨勢(shì)。

通過(guò)分析得到最佳條件的理論值為，接種量3.29%，培養(yǎng)溫度34.71℃，培養(yǎng)時(shí)間74.4 h，此培養(yǎng)條件得到MAO抑制率的理論值為72.18%?？紤]到實(shí)際條件，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的最佳優(yōu)化條件:接種量3.3%，培養(yǎng)溫度34.7℃，培養(yǎng)時(shí)間74 h。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值得MAO抑制率的驗(yàn)證值為(71.98±0.16)%，與理論值接近(相對(duì)誤差為0.3%)，結(jié)果表明采用響應(yīng)面分析法得到的發(fā)酵培養(yǎng)條件基本準(zhǔn)確，具有實(shí)用價(jià)值。

圖6 接種量和培養(yǎng)溫度交互影響MAO抑制率的等高線圖及其曲面圖Fig.6 Contour plot and respective response surface plot of MAO inhibition rate of Lb.rhamnosus KF7 fermented skim milk affected by inoculum ratio and culture temperature

圖7 接種量和培養(yǎng)時(shí)間交互影響MAO抑制率的等高線圖及其曲面圖Fig.7 Contour plot and respective response surface plot of MAO inhibition rate of Lb.rhamnosus KF7 fermented skim milk affected by inoculum ratio and incubation time

圖8 培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間交互影響MAO抑制率的等高線圖及其曲面圖Fig.8 Contour plot and respective response surface plot of MAO inhibition rate of Lb.rhamnosus KF7 fermented skim milk affected by culture temperature and time

3 結(jié)論與討論

單因素實(shí)驗(yàn)表明隨接種量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間的增大，發(fā)酵脫脂乳上清的MAO抑制率的趨勢(shì)是先增大后減小，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)找到每一個(gè)因素的較優(yōu)點(diǎn)，從而在響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中能夠選取合適的水平。

本文通過(guò)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化過(guò)程具有較高的準(zhǔn)確性和精確性。通過(guò)對(duì)模型進(jìn)行方差分析，顯示該模型能夠用于鼠李糖乳桿菌KF7產(chǎn)單胺氧化酶抑制劑的發(fā)酵條件的預(yù)測(cè)和分析。最終得到的最佳發(fā)酵條件為:接種量3.3%，培養(yǎng)溫度34.7℃，培養(yǎng)時(shí)間74 h，驗(yàn)證得到的MAO抑制率為71.98%。

目前具有MAO抑制作用的天然產(chǎn)物主要是從植物中得到，采用微生物發(fā)酵方法制備MAO抑制劑的研究相對(duì)較少。人體多種精神和神經(jīng)系統(tǒng)疾病都與MAO的失調(diào)有關(guān)，MAO抑制劑則起到緩解和治療作用，MAO抑制劑的研究和開發(fā)是具有醫(yī)學(xué)價(jià)值的，從天然產(chǎn)物到化學(xué)合成，得到了不同種類具有價(jià)值的MAO抑制劑。針對(duì)這一現(xiàn)狀，在前期的研究中，我們通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌KF7發(fā)酵脫脂乳的產(chǎn)物具有較高的MAO抑制作用。為了進(jìn)一步的研究，首先通過(guò)對(duì)Lb.rhamnosus KF7產(chǎn)單胺氧化酶抑制劑的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高發(fā)酵脫脂乳對(duì)MAO的抑制作用，從而為接下來(lái)的工作提供依據(jù)。

［1］Malorni W，Giammarioli A M，Matarrese P，et al.Protection against apoptosis by monoamine oxidase A inhibitors［J］.FEBS Letters，1998，426(1):155－159.

［2］金國(guó)章，鄒岡，胥彬.治療精神病藥物單胺氧化酶抑制劑的進(jìn)展概況［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1963，10(1):51－63.

［3］Lee S A，Hwang J S，Han X H，et al.Methylpiperate derivatives from Piper longum and their inhibition of monoamine oxidase ［J］.Archives of Pharmacal Research，2008，31(6):679－683.

［4］Han X H，Hong S S，Hwang J S，et al.Monoamine oxidase inhibitory components from Cayratia japonica［J］.Archives of Pharmacal Research，2007，30(1):13－17.

［5］Haraguchi H，Tanaka Y，Kabbash A，et al.Monoamine oxidase inhibitors from Gentiana lutea［J］.Phytochemistry，2004，65(15):2 255－2 260.

［6］Olsen H T，Stafford G I，Van S J，et al.Isolation of the MAO-inhibitor naringenin from Mentha aquatica L ［J］.Journal of Ethnopharmacology，2008，117(3):500－502.

［7］Shen Q，Shang N，Li P L.In vitro and in vivo antioxidant activity of Bifidobacterium animalis 01 isolated from centenarians［J］.Current microbiology，2011，62(4):1 097－1 103.

［8］王豪，郭本恒，王蔭榆，等.具有抑制單胺氧化酶活性的干酪乳桿菌JH-23生長(zhǎng)特性及生理功能研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，31(11):168－171.

［9］何一薇，郭本恒，陳衛(wèi)，等.干酪乳桿菌JH23代謝產(chǎn)物對(duì)單胺氧化酶的抑制作用［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012，24(7):882－887.

［10］Stafford G I，Pedersen P D，Jager A K，et al.Monoamine oxidase inhibition by southern African traditional medicinal plants［J］.South African Journal of Botany，2007，73(3):384－390.

［11］Krajl M.A rapid microfluorimetric determination of monoamine oxidase［J］.Biochemical Pharmacology，1965，14(11):1 684.

［12］Schmidt K，LI Z，Schubert B，et al.Screening of entomopathogenic Deuteromycetes for activities on targets involved in degenerative diseases of the central nervous system［J］.Journal of Ethnopharmacology，2003，89(2):251－260.

［13］Ashby J R C R，Carr L A，Cook C L，et al.Alteration of platelet serotonergic mechanisms and monoamine oxidase activity in premenstrual syndrome［J］.Biological Psychiatry，1988，24(2):225－233.

［14］胡明明，張國(guó)文，何力.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取花生殼多酚［J］.南昌大學(xué)學(xué)報(bào):理科版，2011，35(3):241－246.