邵平，裴亞萍，陳曉曉，陳蒙，孫培龍

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州，310014)

石莼(Ulva fasciata)又名海白萊、海萵苣，屬綠藻門石莼科的藥食兩用海藻，常見種類主要有孔石莼、石莼、礪菜、裂片石莼等。在長(zhǎng)江以南沿海地區(qū)廣泛分布，浙江沿海資源豐富。文獻(xiàn)記載有軟堅(jiān)散結(jié)、清熱解毒、利水降脂等作用［1］?，F(xiàn)代研究表明，石莼有抗凝血、凈化血液、抗病毒和降膽固醇等作用，其主要活性成分為多糖［2］。

國(guó)內(nèi)外對(duì)石莼的研究起步較早但不夠深入［1－4］。目前為止對(duì)石莼的研究主要集中在孔石莼方面，對(duì)裂片石莼的研究甚少，石莼多糖的提取仍停留在熱水浸提法上，未見采用超聲波輔助提取法報(bào)道，對(duì)其理化性質(zhì)的研究不夠深入。

海藻多糖中含有大量的羥基，能與水分子形成化學(xué)鍵，具有一定的吸濕作用，是保潤(rùn)作用的主要成分，且藻類中的多糖含量豐富，開發(fā)應(yīng)用浙江沿海藻類具有巨大潛力。朱尊權(quán)等人將羊棲菜提取液作為煙用料液加入到卷煙煙絲上，在燃吸卷煙時(shí)可產(chǎn)生特有的化學(xué)成分，明顯改善或提高卷煙的質(zhì)量品質(zhì)［5］。不同的海藻中含有的多糖不同，不同的多糖燃吸的口感也不同，但到目前為止還未見將裂片石莼多糖應(yīng)用于煙草保潤(rùn)的報(bào)道。

本文選取南麂列島地產(chǎn)裂片石莼為研究對(duì)象，優(yōu)化超聲波輔助提取裂片石莼多糖的工藝條件，并對(duì)多糖樣品的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析，并將其添加到煙絲中對(duì)制備樣品卷煙進(jìn)行綜合感官評(píng)吸，為海洋綠藻資源的綜合開發(fā)利用提供的參考。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備與儀器

DJ-04型中藥粉碎機(jī)(上海淀久儀器);AL104電子天平(感量:0.0001 g，梅特勒-托利多儀器有限公司);FS-1200型直插式超聲波細(xì)胞破碎器(上海生析超聲儀器有限公司);CR21GII型高速冷凍離心機(jī)(日本日立公司);RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);752型紫外可見分光光度計(jì)(上海光學(xué)儀器有限公司);ALPHA 2-4LD PLUS型真空冷凍干燥機(jī)(德國(guó)Marin Christ公司);HWS-150型恒溫恒濕箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);Nicolet 6700型傅里葉紅外光譜儀(Thermo Electron公司);UV-2450PC紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)。

1.2 材料與試劑

裂片石莼，采自浙江溫州平陽縣南麓列島，經(jīng)過淡水反復(fù)沖洗，陰干，放于60℃烘干保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑:葡萄糖(廣東光華化學(xué)廠有限公司);濃HCl、濃H2SO4(衢州巨化試劑有限公司);苯酚(浙江杭州雙林化工試劑廠);體積分?jǐn)?shù)95%乙醇(安徽安特生物化學(xué)有限公司);考馬斯亮藍(lán)G-250(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、牛血清血蛋白(上海伯奧生物科技有限公司)、CaCl2(上海試四赫維化工有限公司)、H3PO4(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司);明膠(中國(guó)上海試劑總廠);BaCl2(上海泗聯(lián)化工廠有限公司);三氯乙酸(如皋市金陵試劑廠);K2SO3(上海振欣試劑廠)，以上樣品試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 裂片石莼粗多糖的提取工藝流程

裂片石莼→粉碎→過篩→超聲波輔助提取→離心取上清液→濃縮→80%乙醇沉淀→離心取沉淀→冷凍干燥

1.3.2 多糖提取率的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量［6］。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=6.954 8X－0.047 9(R2=0.999 1，說明線性關(guān)系良好)。多糖提取率計(jì)算公式如下:

式中:c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得糖濃度(mg/mL);n為稀釋倍數(shù);V為原液體積(mL);m為原料質(zhì)量(g)。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，通過對(duì)料液比、提取時(shí)間、功率和脈沖循環(huán)時(shí)間的單因素試驗(yàn)考察，選取對(duì)提取工藝影響顯著的3個(gè)因素，分別為提取時(shí)間(20、30、40 min)，功率(480、600、720 W)，脈沖循環(huán)時(shí)間(0、4、8 s)，分別以 A、B、C 代表，每個(gè)自變量的低、中、高實(shí)驗(yàn)水平分別以－1、0、1進(jìn)行編碼，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 響應(yīng)面分析因子及水平Table 1 Factors and levels of RSM analysis

1.3.4 裂片石莼粗多糖理化性質(zhì)分析

物理性質(zhì)分析:觀察多糖的色、溴、味，觀察多糖在水及幾種有機(jī)溶劑中的溶解性。

化學(xué)性質(zhì)分析:Molish反應(yīng)、苯酚-硫酸反應(yīng)、Fehling反應(yīng)。

(1)粗多糖中總糖含量的測(cè)定:苯酚-硫酸法，同1.3.2。

(2)粗多糖中蛋白含量的測(cè)定:考馬斯亮藍(lán)法［7］。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 Y=5.879 8X+0.010 8，R2=0.992 2。

(3)粗多糖中硫酸根含量的測(cè)定:硫酸鋇比濁度法［8］。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 Y=0.003 1X+0.001 3，R2=0.992 2。

(4)粗多糖中糖醛酸含量的測(cè)定:硫酸-咔唑比色法［9］。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 Y=0.010 9X+0.018 4，R2=0.998 1。

(4)裂片石莼多糖的紫外全掃描:稱取粗多糖2 mg，溶于蒸餾水中稀釋至1 mg/mL，于190～600 nm下進(jìn)行紫外全掃描。

(5)裂片石莼多糖的紅外光譜:將干燥的粗多糖樣品于KBr壓制成片，用紅外光譜儀，掃描400～4 000 cm－1波長(zhǎng)范圍的光譜吸收值。

1.3.5 樣品煙的制備和評(píng)吸

稱取適量的煙絲在恒溫(22℃ ±1℃)恒濕(相對(duì)濕度為60% ±2%)箱內(nèi)平衡48 h，將裂片石莼多糖配成1 mg/mL的溶液，取5 mL均勻噴灑在25 g煙絲上，于恒溫恒濕箱中平衡48 h(條件同上)，用手動(dòng)打煙機(jī)打煙，每支卷煙保持在0.7 g煙絲，煙絲分布均勻，軟硬適中，送往浙江中煙公司讓專業(yè)評(píng)吸人員進(jìn)行綜合感官評(píng)吸。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲波提取過程中單因素的影響

2.1.1 料液比對(duì)多糖提取率的影響

由于裂片石莼葉肉中水分含量較少，推測(cè)料液比是影響多糖提取率的重要因素。從圖1可知，料液比的增大對(duì)提高裂片石莼多糖提取率的效果不顯著，曲線較平緩，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，多糖提取率就達(dá)到9.96%，增大料液比，提取率未見增加。當(dāng)料液比為1∶20、1∶60、1∶100時(shí)，多糖提取率較為接近，由于后續(xù)工序中需經(jīng)濃縮，若初期加水量過大會(huì)使后續(xù)工序能耗增加，效率降低，因此選擇料液比為1∶20左右較為合適。

圖1 料液比對(duì)裂片石莼多糖提取率的影響Fig.1 Effect of solid/liquid ratio on polysaccharide extraction rate

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

從圖2可知，隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取率不斷增加，由4.19%增加到9.68%，提取率在30 min之前增加較顯著，30 min時(shí)達(dá)到最大為9.68%，以后趨于平緩，為縮短工時(shí)減少能耗，選擇最佳提取時(shí)間為30 min。

2.1.3 超聲功率對(duì)多糖提取率的影響

圖2 提取時(shí)間對(duì)裂片石莼多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on polysaccharide extraction rate

從圖3可知，當(dāng)提取功率為240、360 W時(shí)，多糖提取率較低，分別為3.28%、4.00%。但隨著功率增加多糖的提取率顯著提高，480 W時(shí)達(dá)到9.61%，繼續(xù)增大功率提取率上升不明顯。綜合考慮提取率和能耗，選擇最佳提取功率為600 W。

圖3 超聲功率對(duì)裂片石莼多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on polysaccharide extraction rate

2.1.3 超聲脈沖循環(huán)時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

脈沖循環(huán)時(shí)間是一個(gè)周期內(nèi)超聲波脈沖作用的時(shí)間，如脈沖循環(huán)時(shí)間為4 s，就是超聲波處理樣品時(shí)，4 s作用于樣品4 s停留，如此循環(huán);脈沖循環(huán)時(shí)間為0 s代表一直超聲;脈沖循環(huán)時(shí)間是影響超聲波提取效率的一個(gè)重要條件。從圖4可知，當(dāng)脈沖循環(huán)時(shí)間為1 s時(shí)，多糖提取率最低，為3.80%;當(dāng)脈沖循環(huán)時(shí)間為8 s時(shí)，多糖提取率達(dá)到最高為11.70%;在脈沖循環(huán)時(shí)間為0 s和4 s時(shí)，多糖的提取率分別為8.96%和11.22%。綜合考慮，選取脈沖循環(huán)時(shí)間為4s為最佳。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化裂片石莼多糖提取的工藝參數(shù)

2.2.1 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2、表3。利用Design Expert 8.5軟件對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得裂片石莼多糖提取率對(duì)提取時(shí)間、超聲功率和脈沖循環(huán)時(shí)間的多元二次回歸方程因素代碼形式為:

圖4 脈沖循環(huán)時(shí)間對(duì)裂片石莼多糖提取率的影響Fig.4 Effect of pulse recurrent time on polysaccharide extraction rate

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experiment design and results of RSM

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA regression model

由表3顯著性檢驗(yàn)表明，模型回歸達(dá)到極顯著的水平，模型的決定系數(shù)R2=0.951 5，說明模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合有97.91%的符合度;校正決定系數(shù)=0.903 0，說明該模型能解釋90.30%響應(yīng)值的變化;失擬值P值0.309 8，說明檢驗(yàn)結(jié)果與模型計(jì)算結(jié)果沒有顯著差異;若模型很好地預(yù)測(cè)了實(shí)際結(jié)果，則F檢驗(yàn)值應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于理論計(jì)算值，此模型的F檢驗(yàn)值為19.62，理論值在0.05水平上查表可得 F(8，4)=6.04，說明方差顯著性很高，因此可以用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)［11］。

2.2.1 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線如圖5～圖7所示，各個(gè)因素及其相互間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響結(jié)果通過該組圖可以直觀地反映出來。

由圖5可知，與超聲功率相比，提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響呈現(xiàn)較為平緩的趨勢(shì)，超聲功率的影響較大，曲線陡峭且呈先逐漸上升后稍微下降的趨勢(shì)，超聲功率與提取時(shí)間的交互作用不顯著，兩者各自與多糖提取率相關(guān)。由圖6可知，脈沖循環(huán)時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響大于提取時(shí)間，兩者無交互作用。由圖7可知，與脈沖循環(huán)時(shí)間相比，超聲功率對(duì)多糖提取率的影響更為顯著，且兩者無交互作用。從這3組圖可以看出，影響裂片石莼多糖提取率最顯著的因素為超聲功率，表現(xiàn)為響應(yīng)面變化弧度較大，其次是脈沖循環(huán)時(shí)間，提取時(shí)間響應(yīng)面弧度變化平緩，說明對(duì)響應(yīng)值的影響較小。

圖5 Y=f(A，B)的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Responsive surfaces and contours of Y=f(A，B)

圖6 Y=f(A，C)的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Responsive surfaces and contours of Y=f(A，C)

圖7 Y=f(B，C)的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Responsive surfaces and contours of Y=f(B，C)

2.2.3 最佳工藝的求解

通過Design-Expert軟件對(duì)上述方程進(jìn)行求解，得到最佳的提取條件為:提取時(shí)間32.99 min，超聲功率618.97 W，脈沖循環(huán)時(shí)間為0 s即一直超聲，在此條件下，裂片石莼多糖提取率的理論值可達(dá)14.20%。為檢驗(yàn)該法的可靠性，考慮到實(shí)際操作的便利，將最佳工藝修正為超聲時(shí)間33 min，超聲功率620 W，脈沖循環(huán)時(shí)間為0 s，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，經(jīng)3次平衡試驗(yàn)，實(shí)際多糖提取率為14.11%、14.09%、14.21%，與回歸模型預(yù)測(cè)的多糖提取率無顯著差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型符合良好，該模型可較好地模擬和預(yù)測(cè)裂片石莼多糖的提取率。

2.3 裂片石莼粗多糖理化性質(zhì)分析

2.3.1 裂片石莼粗多糖的物理性質(zhì)

裂片石莼多糖干品呈灰白色粉末，無味、無溴、易溶于水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚、三氯甲烷等有機(jī)溶劑。

2.3.2 裂片石莼粗多糖的化學(xué)性質(zhì)

Molish反應(yīng)呈陽性，說明樣品中含有游離或結(jié)合的糖;苯酚-硫酸反應(yīng)呈陽性，說明有多糖的存在;Fehling反應(yīng)呈陽性，說明有還原性糖存在。

2.3.3 裂片石莼粗多糖的主要成分分析

查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)多糖的活性與其主要成分有很大關(guān)系，其中多糖含量和硫酸根含量對(duì)其活性影響最大，潘路路等的研究發(fā)現(xiàn)隨著硫酸根含量的增加，鼠尾藻多糖的抗氧化活性隨之增加［12］。周軍明等的研究也發(fā)現(xiàn)硫酸根含量高的褐藻糖膠其抗氧化活性也較強(qiáng)［13］。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)超聲波輔助提取所得裂片石莼粗多糖進(jìn)行主要成分分析。結(jié)果顯示裂片石莼粗多糖中總糖的含量為38.63%、糖醛酸含量為35.06%，硫酸根含量為 19.41%，蛋白質(zhì)含量為0.28%。這與諶素華在“綠藻石莼粗多糖提取條件的研究”一文中的結(jié)論基本相符。

2.3.4 裂片石莼粗多糖的紫外全掃描和紅外光譜

裂片石莼粗多糖的紫外全掃描圖譜如圖8所示，可知裂片石莼粗多糖在206 nm左右有較大的吸收峰，為裂片石莼多糖的特征吸收峰，其中粗多糖在260 nm處有吸收峰，說明多糖組分含有核酸類物質(zhì)，在280 nm處無吸收峰，說明蛋白質(zhì)含量很少或不含有蛋白質(zhì)，這與結(jié)果2.3.3中所得蛋白質(zhì)含量為0.28%保持了一致。

圖8 裂片石莼多糖紫外全掃描光譜圖Fig.8 UV scanning curve of UFP

裂片石莼粗多糖的紅外光譜如圖9所示。從圖9可知位于3 450～3 410 cm－1有一寬且強(qiáng)的吸收峰，系多糖的—OH產(chǎn)生;2 940 cm－1附近的尖峰是飽和C—H伸縮振動(dòng)的信號(hào);在1 634 cm－1附近振動(dòng)峰的出現(xiàn)，表明有C O羧基的存在，即多糖中含有糖醛酸，為酸性多糖;1 424 cm－1附近出現(xiàn)的峰是由于C—H的彎曲振動(dòng)引起的;1063 cm－1左右有一較強(qiáng)寬吸收帶，為多糖各糖殘基之間糖苷鍵C—O—C的振動(dòng)峰;1 240 cm－1的強(qiáng)峰和840 cm－1、791 cm－1附近的2尖峰是硫酸基的吸收信號(hào)［14］。這些都與結(jié)果2.3.3的結(jié)論是相一致的。

圖9 裂片石莼多糖紅外光譜圖Fig.9 IR spectrum of UFP

2.3.5 裂片石莼多糖在煙草上的應(yīng)用

添加裂片石莼多糖后的卷煙樣品，總體有提升，外加物質(zhì)香氣較顯著，透發(fā)性變好，煙氣變細(xì)膩，干燥感有改善，對(duì)于卷煙感官清爽度、舒適度的提高具有一定作用，是很好的煙草保潤(rùn)增香劑。

3 結(jié)論

(1)本實(shí)驗(yàn)通過單因素和響應(yīng)曲面分析法對(duì)裂片石莼多糖超聲波輔助提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到的最佳提取工藝條件為:提取時(shí)間為33 min，超聲功率為620 W，脈沖循環(huán)時(shí)間為0 s時(shí)，多糖提取率最高，為14.20%。響應(yīng)面分析表明，超聲功率對(duì)多糖提取率的影響最為顯著，為關(guān)鍵因素，脈沖循環(huán)時(shí)間次之，提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響較小。

(2)提取所得裂片石莼多糖為灰白色粉末，無味、無溴、易溶于水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚、三氯甲烷等有機(jī)溶劑。Molish反應(yīng)呈陽性，苯酚-硫酸反應(yīng)呈陽性，F(xiàn)ehling反應(yīng)呈陽性。

(3)測(cè)得粗多糖中所得粗多糖中總糖含量為38.63%;采用硫酸-咔唑比色法測(cè)得糖醛酸含量為35.06%;且對(duì)其有效活性成分-硫酸根含量進(jìn)行測(cè)定，硫酸根含量為19.41%;采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得粗多糖中蛋白質(zhì)含量為0.28%，含量較低，說明粗多糖中雜質(zhì)較少。

(4)將裂片石莼多糖應(yīng)用于卷煙，整體評(píng)吸效果較好，香氣提升較顯著，透發(fā)性變好，煙氣變細(xì)膩，清爽度，舒適感提高，干燥感有所改善。

［1］徐娟華，丁紅霞.綠藻石莼多糖的提取工藝［J］.中藥與天然藥物，2002，33(10):476－477.

［2］西澤一俊.海藻生理活性物質(zhì)［J］.中國(guó)海洋藥物雜，1993(1):47－51.

［3］Yu P Z，Zhang Q B，Li N.Polysaccharides from Ulva pertusa(Chlomphyta)and preliminary studies on their antihyperlipidemia activity［J］.Journal of Applied Phycology，2003，15(1):21－27.

［4］諶素華，王維民，吳麗萍.綠藻石莼粗多糖提取條件的研究［J］.科學(xué)研究，2008，29(9):68－71.

［5］朱尊權(quán)，胡有持，周細(xì)才，等.羊棲菜水提取液及其在煙草中的應(yīng)用［P］.中國(guó)，200610128283.3，2006－11－25.

［6］張惟杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)［M］.杭州:浙江大學(xué)出版社，1999.

［7］Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein using the principle of protein-dye binding［J］.Analytical Biochemistry.1976，72:248－254.

［8］強(qiáng)亦忠，王崇道，邵源，等.海藻硫酸多糖的制備及其性質(zhì)研究［J］.蘇州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2003，23(4):391－393.

［9］林穎，黃琳娟，田庚元.一種改良的糖醛酸含量測(cè)定方法［J］.中草藥，1999，30(11):817－819.

［10］Guo X，Zou X，Sun M.Optimization of extraction process by response surface methodology and preliminary characterization of polysaccharides from Phellinus igniarius［J］.Carbohydrate Polymers，2010，80(2):344－349.

［11］魏海龍，賀亮，甘慶軍.茯苓菌絲體多糖徑向流色譜分離參數(shù)優(yōu)化［J］.浙江林業(yè)科技，2011，31(2):1－5.

［12］潘路路.鼠尾藻多糖的提取、硫酸化修飾及抗氧化活性初步研究［D］.南寧:廣西大學(xué)，2010.

［13］周軍明.褐藻糖膠提取純化、結(jié)構(gòu)分析及抗氧化研究［D］.杭州:浙江大學(xué)理學(xué)院，2006.

［14］王艷梅，牛錫珍，張虹等.孔石莼多糖的分離分析［J］.中國(guó)海洋藥物，2002(6):4－7.