舒孝順，卿婉華，許凱揚(yáng)，劉瑞興，陶鈞，龔福春

(長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙，410004)

目前，提取金銀花及山銀花中綠原酸采用的方法［5－6］很多，本研究借助于微波提取技術(shù)具有快速簡(jiǎn)便、高效、不易破壞天然活性成分等優(yōu)點(diǎn)，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)、溶劑pH值5個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，然后篩選4個(gè)因素進(jìn)行正交L9(34)試驗(yàn)，以確定紅腺忍冬花綠原酸微波醇提的適宜工藝條件。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與藥品

1.1 材料及其預(yù)處理

紅腺忍冬山銀花，購(gòu)自長(zhǎng)沙高橋藥材市場(chǎng)，經(jīng)筆者鑒定、核實(shí)為紅腺忍冬 Lonicera hypoglauca Miq.。將從藥材店購(gòu)買(mǎi)的紅腺忍冬山銀花，于60℃ 烘箱中烘至恒重。用粉碎機(jī)粉碎，并過(guò)40目篩。放置干燥環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器

UV-2550紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司)，F(xiàn)A-1104型電子分析天平(上海精勝科學(xué)儀器有限公司)，LD-06A型300 g裝高速中藥粉碎機(jī)(上?？七_(dá)醫(yī)學(xué)儀器設(shè)備有限公司)，電熱恒溫水浴鍋(京泰克儀器有限公司)，MAS-II微波輻射萃取儀(上海新儀微波化學(xué)科技有限公司)。

1.3 試劑

對(duì)照品綠原酸(批號(hào)110754)為中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;95%工業(yè)乙醇，HCl、乙醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備［7］

精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品10 mg，置50 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)70%乙醇適量，使其完全溶解并稀釋至刻度。然后用移液管吸取7.5 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，加70%乙醇至刻度線，制成15 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于冰箱中避光保存。精密量取對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液 1、2、3、5、7、9、10 mL，分別用體積分?jǐn)?shù) 60%乙醇定容至10mL容量瓶，搖勻，其濃度分別為1.5、3.0、4.5、7.5、10.5、13.5 和15 mg/L。以60%乙醇作參比液，在329.9 nm處測(cè)定其吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度c(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸得綠原酸質(zhì)量濃度c和吸光度A的關(guān)系為:A=0.062 6C－0.006 5，R=0.999 8。

2.2 紅腺忍冬花綠原酸的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)5.000 0 g紅腺忍冬山銀花粉末置于200 mL三角燒瓶中，再加一定體積和pH值的水溶液，在一定微波功率下提取4 min，提取2次，過(guò)濾，合并2次濾液，冷卻后，濾液用無(wú)水乙醇調(diào)到乙醇濃度60%并定容至100 mL。

2.3 綠原酸的含量測(cè)定

精密量取微波輔助提取液1 mL，按照2.1的方法測(cè)定其吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算紅腺忍冬山銀花綠原酸含量及提取率。提取率計(jì)算公式如下:

《饑餓藝術(shù)家》更像是關(guān)于拯救的一個(gè)恰如其分的喻體。饑餓藝術(shù)家把自己像一只動(dòng)物一樣關(guān)在籠子里不吃不喝，以這種自虐展覽作為自己的饑餓藝術(shù)。剛開(kāi)始，好奇的人們還像舉行盛大儀式那樣圍在他籠子前觀看。很快，熱情褪去的人們就開(kāi)始對(duì)他熟視無(wú)睹，沒(méi)有幾個(gè)人愿意在他的籠子前停留；即使是專(zhuān)門(mén)為他饑餓藝術(shù)記數(shù)的工作人員都忘記了他的存在，直到他死去了才被人發(fā)現(xiàn)。

2.4 紅腺忍冬山銀花中綠原酸提取的單因素及正交實(shí)驗(yàn)

選取微波功率、提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比和溶劑pH值為考察因素，分別以其中一個(gè)因素為變量，固定其他因素，考察不同因素的不同水平對(duì)綠原酸含量的影響，在單因素考察的基礎(chǔ)上，選擇其中4個(gè)因素為考察因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，確立因素水平表，見(jiàn)表1，以綠原酸含量為指標(biāo)，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表安排實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 微波功率對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取5份(5.000 0 g)紅腺忍冬山銀花粉末分別置于200 mL三角燒瓶中，再各加pH 3水溶液50 mL(藥材體積10倍)，分別在微波功率為200、300、400、500、600 W 提取 4 min，提取 2 次，過(guò)濾，合并2次濾液，冷卻后，濾液用無(wú)水乙醇調(diào)到乙醇濃度60%并定容至100 mL，測(cè)吸光度并計(jì)算提取率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 微波功率對(duì)提取率的影響Fig.1 Effect of alcohol concentration on Extraction rate

由圖1可以看出，當(dāng)微波功率低于為400W時(shí)，綠原酸的提取率隨著微波功率的升高而顯著增大，當(dāng)微波功率達(dá)到400W時(shí)達(dá)到最大值，提取率達(dá)到最大值4.32%，增大微波功率能快速提高浸提液的溫度，有利于綠原酸的溶解和擴(kuò)散到溶劑中;但如果微波功率過(guò)大，則會(huì)導(dǎo)致綠原酸的結(jié)構(gòu)在較長(zhǎng)時(shí)間的高溫條件下出現(xiàn)降解，因此，選定300、400和500 W作為正交實(shí)驗(yàn)中微波功率的3個(gè)水平。

2.1.2 溶劑體積(藥材重量倍數(shù))對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取5份(5.000 0 g)紅腺忍冬山銀花粉末分別置于200 mL三角燒瓶中，再各加8、10、12、14、16倍藥財(cái)體積pH 3的水溶液，分別在微波功率為400 W提取4 min，提取2次，過(guò)濾，合并2次濾液，冷卻后，濾液用無(wú)水乙醇調(diào)到乙醇濃度60%并定容至100 mL，測(cè)吸光度并計(jì)算提取率，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate

由圖2可以看出當(dāng)溶劑體積倍數(shù)達(dá)到12倍時(shí)，提取率達(dá)到最大值4.45%，之后隨著溶液體積的增大，提取率增加量少且緩慢，若再提高料液比會(huì)給后續(xù)濃縮工序帶來(lái)困難，所以從經(jīng)濟(jì)方面考慮，故選擇料液比1∶12為后續(xù)實(shí)驗(yàn)固定值。

2.1.3 溶劑pH值對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取5份(5.000 0 g)紅腺忍冬山銀花粉末置于5個(gè)200 mL三角燒瓶中，再分別加12倍藥材體積 pH 為2、3、4、5、6 的水溶液，在微波功率為 400 W提取4 min，提取2次，過(guò)濾，合并2次濾液，冷卻后，濾液用無(wú)水乙醇調(diào)到乙醇體積分?jǐn)?shù)60%并定容至100 mL，測(cè)吸光度并計(jì)算提取率，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可以看出，開(kāi)始時(shí)隨著溶劑pH的不斷提高，綠原酸的提取率也跟著上升，在pH 4時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，提取率達(dá)到最大值4.49%，之后隨pH值提高提取率反而下降，可能由于綠原酸在酸性環(huán)境中能穩(wěn)定存在，而在較高pH時(shí)變得不穩(wěn)定而引起降解，因此，選定3、4和5作為正交實(shí)驗(yàn)中pH值的3個(gè)水平。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

圖3 溶劑PH對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of solvent pH on extraction rate

準(zhǔn)確稱(chēng)取5份(5.000 0 g)紅腺忍冬山銀花粉末置于5個(gè)200 mL三角燒瓶中，各加60 mL pH值為4的水溶液，在微波功率為400 W下分別提取2、3、4、5、6 min，提取2次，過(guò)濾，合并2次濾液，冷卻后，無(wú)水乙醇調(diào)到乙醇濃度60%并定容至100 mL，測(cè)吸光度并計(jì)算提取率，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate

由圖4可以看出，在2～5 min內(nèi)，綠原酸提取率隨時(shí)間增加不斷增長(zhǎng)，在5 min基本上達(dá)到最大值，提取率達(dá)到4.46%，之后此時(shí)綠原酸基本上已提取，由于綠原酸對(duì)溫度敏感，長(zhǎng)時(shí)間在較高溫度不穩(wěn)定易降解，同時(shí)從生產(chǎn)周期方面考慮，因此，選定3、4和5 min作為正交實(shí)驗(yàn)中提取時(shí)間的3個(gè)水平。

2.1.5 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取5份(5.000 0 g)紅腺忍冬山銀花粉末置于5個(gè)200 mL三角燒瓶中，各加60 mL pH值為4的水溶液，在微波功率為400 W下，分別提取1、2、3、4、5次，每次提取4 min，過(guò)濾，合并兩次濾液，冷卻后濾液用無(wú)水乙醇調(diào)到乙醇濃度60%并定容至100 mL，測(cè)吸光度并計(jì)算提取率，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可以比較得出，當(dāng)提取次數(shù)為2次時(shí)，提取率基本上達(dá)到一個(gè)最大值，提取率達(dá)到4.51%，之后，因此隨著提取次數(shù)增加提取率增加不大，因此我們選定1、2和3次作為正交實(shí)驗(yàn)中提取次數(shù)的3個(gè)水平。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

圖5 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction rate

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇微波功率、提取時(shí)間、溶劑pH和提取次數(shù)4個(gè)因素，以綠原酸提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因數(shù)水平表Table 1 Factor standard

表2 綠原酸提取正交實(shí)驗(yàn)表Table 2 Orthographic experiment result L9(34)

由表2可知，影響微波輔助提取紅腺忍冬花中綠原酸的主次因素是:微波功率＞提取次數(shù)＞溶劑PH＞提取時(shí)間，最佳工藝條件為A2B3C1D2，即微波功率400 W、溶劑pH3、提取時(shí)間5 min、提取2次，在此最佳條件下紅腺忍冬花中綠原酸的提取率高達(dá)4.54%。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取5.000 g紅腺忍冬花粉末3份，按最佳提取方案A2B3C1D2進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)定綠原酸含量，結(jié)果3份樣品的綠原酸含量平均值為4.48%，RSD為O.54%，與正交實(shí)驗(yàn)中提取率最高的工藝A2B3C1D2的含量4.57%相比，提取率較為接近。表明該提取工藝穩(wěn)定、合理，方案可行。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以紅腺忍冬花為原料，以水為提取溶劑，采用微波輔助萃取，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化，紅腺忍冬花中綠原酸的微波提取最佳工藝條件為A2B3C1D2，微波功率400 W、溶劑pH3、提取時(shí)間5 min、提取2次，在最佳提取條件下，綠原酸提取率高達(dá)4.54%，該工藝較為穩(wěn)定、合理、可行性較高，適合于紅腺忍冬花綠原酸的工業(yè)生產(chǎn)。

本實(shí)驗(yàn)利用微波提取方法，可以極大地縮短提取時(shí)間，且能達(dá)到較高的提取效率。與傳統(tǒng)加熱提取及超聲波提取法相比，微波輔助提取具有極大地縮短提取時(shí)間，而且耗能低、提取率較高的優(yōu)點(diǎn)。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:28.

［2］楊玉琴，張麗艷，高言明，等.黔產(chǎn)黃褐毛忍冬與國(guó)內(nèi)其他主產(chǎn)區(qū)紅腺忍冬品質(zhì)對(duì)比研究［J］.中南藥學(xué)，2006，4(3):182－184.

［3］粟時(shí)穎，鄭興，廖端芳.山銀花研究進(jìn)展［J］.南華大學(xué)學(xué)報(bào)·醫(yī)學(xué)版，2009，37(6):744－746.

［4］辛華，單義曼，王柳萍.廣西產(chǎn)紅腺忍冬有效成分的含量測(cè)定研究［J］.廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，15(1):51－53.

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