李永偉 楊躍武 陸慧瓊

中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院中醫(yī)科，廣東廣州 510630

痰熱清注射液屬國家新藥中藥二類，方中以黃芩為君藥，熊膽粉、山羊角為臣藥，金銀花為佐藥，連翹為使藥[1]，具有清熱、解毒、化痰等功效，主治急性支氣管炎、急性肺炎（早期）出現(xiàn)的痰熱阻肺癥狀，但其主要藥物如黃芩、熊膽粉、山羊角俱為歸于肝膽經(jīng)的藥物，其中，綠原酸對肝癌還具有顯著的抑制作用[2]，但未見痰熱清復(fù)方注射液用于治療肝癌的相關(guān)文獻報道。中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院臨床采用痰熱清注射液治療中醫(yī)證型辨證為肝膽濕熱的肝炎、肝硬化和肝癌在內(nèi)的多種肝臟疾病，結(jié)果顯示可減少肝癌介入栓塞術(shù)后綜合征，如發(fā)熱、腹痛、嘔吐等癥狀[3]。本研究初步觀察了痰熱清注射液對肝癌細胞株HepG2生長及細胞周期的影響，現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM 培養(yǎng)基（GIBCO 公司），MTT（Sigma公司），胎牛血清（杭州四季青公司），96孔、6孔培養(yǎng)板及25 cm2培養(yǎng)瓶（COSTER 公司），酶標(biāo)儀（BIO-RAD、Model450 MICRoPLATE READER），痰熱清注射液由上海凱寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z20030054。

1.2 細胞抑制率檢測

采用MTT法。

1.2.1 細胞培養(yǎng)及藥物濃度設(shè)定 收集復(fù)蘇后培養(yǎng)傳代5代以內(nèi)對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，96孔板中每孔加入200 μL鋪板，使待測細胞密度調(diào)至5000個/孔。細胞生長48 h后，根據(jù)多次預(yù)實驗結(jié)果，將痰熱清注射液按原藥物濃度用DMEM倍比稀釋成8個濃度梯度：40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mg/L，并設(shè)空白對照組，每組設(shè)4個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.2.2 細胞抑制率測定 加入藥物后培養(yǎng)48 h，先棄去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗 3遍后，每孔加入 20 μL MTT溶液（5 mg/mL），加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀OD 490 nm處測量各孔的吸光值。檢測時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜）、對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），并另設(shè)不加MTT的對照孔（即細胞、相同濃度的藥物、培養(yǎng)液、二甲基亞砜），實驗孔吸光值減去不加MTT的對照孔值為矯正后的實驗孔值。細胞抑制百分率（%）=（細胞對照組平均A值-實驗組平均A值）/細胞對照組平均A值×100%；細胞半數(shù)有毒濃度（TC50）=antilog[B+（50-B）/（AB）×C]；A=log（＞50%藥物含量）；B=log（＜50%藥物含量）；C=log（稀釋倍數(shù)）[4]。

1.3 細胞周期檢測

采用凱基細胞DNA含量（細胞周期）即時檢測試劑盒。

1.3.1 細胞培養(yǎng)及分組 將HepG2細胞鋪于6孔板，細胞調(diào)密度至1×105/孔，采用DMEM混合培養(yǎng)液（含10%胎牛血清 ），置5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，48 h后按照 TC50加入濃度分別為2.5、1.25、0.625 mg/L的痰熱清注射液，并加培養(yǎng)液至2 mL，再培養(yǎng)48 h后收集細胞行流式細胞儀檢測，每組3個復(fù)孔，同時設(shè)立空白對照組。

1.3.2 細胞周期檢測 收集106個細胞，用1 mL PBS重新懸浮，離心后棄上清；加入0.5 mL Solution Buffer懸浮細胞，離心棄上清；再加入0.5 mL Solution Buffer懸浮細胞，離心棄上清；加入 250 μL Solution A，25℃孵育 10 min；加入200 μL Solution B，25℃孵育 10 min；最后加入 200 μL Solution C，4℃避光10 min；上機檢測，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光。取各劑量組均數(shù)計算細胞增殖指數(shù)，細胞增殖指數(shù)=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，采用Probit分析計算TC50，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 痰熱清注射液對HepG2細胞增殖的抑制情況

痰熱清注射液對HepG2細胞增殖的抑制實驗結(jié)果顯示，不同濃度的痰熱清對HepG2細胞均有不同程度的抑制作用，隨著藥物濃度增高，抑制作用逐漸增強。痰熱清注射液對HepG2細胞的TC50為3.62 mg/L。痰熱清注射液作用48 h后對HepG2細胞的生長抑制情況見圖1。

2.2 痰熱清注射液對HepG2細胞周期的影響

結(jié)果顯示，2.5 mg/L組痰熱清注射液使細胞阻滯于G0/G1期，該期細胞比率明顯高于其他組（P＜0.01），其他各組間G0/G1期細胞比率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；各組G2/M期細胞比率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；2.5 mg/L組S期細胞比率明顯低于其他組（P＜0.01），1.25 mg/L組S期細胞比率亦明顯低于空白對照組（P＜0.05）；2.5 mg/L組細胞增殖指數(shù)明顯低于其他組（P＜0.01）；各組細胞均未見明顯的凋亡峰。見表1、圖2。

表1 痰熱清注射液對HepG2細胞周期及增殖指數(shù)的影響（±s）

表1 痰熱清注射液對HepG2細胞周期及增殖指數(shù)的影響（±s）

注：與 2.5 mg/L 組比較，*P ＜ 0.01；與空白對照組比較，¤P ＜ 0.05；PI：增殖指數(shù)

組別 G0/G1期（%） S期（%） G2/M期（%） PI空白對照組0.625 mg/L組1.25 mg/L組2.5 mg/L組55.02±0.19*59.05±0.67*57.64±0.25*68.27±2.01 29.28±1.21*26.86±0.14*26.05±0.1*¤19.21±0.39 15.71±1.4 14.9±0.77 15.5±0.4 12.53±1.6 44.98±0.19*40.95±0.68*42.36±0.26*31.74±2.03

3 討論

痰熱清注射液中4種主要成分為綠原酸、黃芩苷、熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸，鵝去氧膽酸為需要限量的毒性成分[5]，前三者均具有利膽作用，且值得注意的是，這三種成分均有抑制腫瘤作用的報道。熊去氧膽酸對HepG2細胞株具有抑制作用，可促使其凋亡，阻滯細胞增殖周期于G0/G1期。動物實驗結(jié)果顯示，熊去氧膽酸可以預(yù)防實驗大鼠肝癌的發(fā)生，明顯減少大鼠肝癌結(jié)節(jié)的數(shù)量[6]。黃芩苷可抑制肝癌HepG2細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，使多數(shù)細胞阻滯于S期[7]。痰熱清注射液中綠原酸含量約為6.0 g/mL[8]，綠原酸可通過抑制細胞生長、調(diào)節(jié)細胞周期、誘導(dǎo)凋亡等途徑產(chǎn)生抗癌作用[9]。在肝癌細胞系Hep3B中，綠原酸的半數(shù)有效抑制濃度（IC50）只需達到30～50 nmol/L即可產(chǎn)生良好的抗金屬蛋白酶9（MMP-9）的功效，因此，其可能具有抑制肝癌轉(zhuǎn)移的作用。甲基四氮鹽實驗研究表明，綠原酸無細胞毒性[10]。動物實驗顯示，綠原酸可抑制化學(xué)物質(zhì)對肝臟的致癌作用[11]。痰熱清注射液含有上述三種具有抑癌作用的成分，但因痰熱清注射液各批次成分含量差異[5]，因此，其抑癌作用結(jié)果需要多次重復(fù)實驗。

本研究結(jié)果顯示，痰熱清注射液8個濃度梯度對肝癌細胞均有抑制作用，并隨劑量的增加抑制作用增強，其機制可能與痰熱清注射液將細胞阻滯于G0/G1期，致細胞DNA合成減少有關(guān)，前者與熊去氧膽酸作用類似，但用于細胞周期檢測的3個濃度并未顯示出促凋亡的作用，因此，需要進一步研究該復(fù)方注射液的抗癌機制。雖然痰熱清導(dǎo)致細胞DNA合成減少，但已合成DNA的細胞仍可進入有絲分裂，導(dǎo)致各組細胞有絲分裂期的結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

用于檢測細胞增殖活力的CCK-8法較MTT法有突破性的改變，如MTT被還原成的甲臜需要二甲亞砜溶解，而CCK-8不需要加入后者；CCK-8中酚紅和血清對測定無明顯影響，不必去上清洗滌細胞，更加簡便，也使結(jié)果數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確及穩(wěn)定。但對于本身為棕紅色透明液體的痰熱清會影響吸光度值，即使不加MTT和細胞，也與實驗孔的吸光度值相近，甚至高于實驗孔。因此，本研究仍采用了MTT法檢測細胞增殖情況，PBS沖洗細胞3次，并設(shè)計了矯正后的實驗孔值以消除藥物本身的影響。

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