楊 楊，劉畢琴，張 發(fā)，廖光輝，楊曉燕

（大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

α-淀粉酶（α-amylase），編號：EC 3.2.1.1，作用于淀粉時從淀粉分子的內(nèi)部隨機(jī)切開α-1，4糖苷鍵，是一種只能催化水解直鏈淀粉的液化酶〔1〕。通常采用酶活力（enzyme activity）來表示酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力〔2〕。一般情況下，α-淀粉酶的作用溫度范圍60～90℃，最適宜作用溫度為60～70℃，作用pH值范圍5.5～7.0，最適pH值為6.0。α-淀粉酶主要存在于人的唾液和胰臟中，也存在于麥芽、蟑螂涎腺、芽孢桿菌、枯草桿菌、黑曲霉和米曲霉中。α-淀粉酶酶制劑大量應(yīng)用于糧食加工、食品工業(yè)、釀造、發(fā)酵、紡織品工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)等，占酶制劑市場份額的25%左右〔3-4〕。目前，工業(yè)生產(chǎn)上都以微生物發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)α-淀粉酶，最常用的方法是從自然界中篩選出可以產(chǎn)這種酶的目的菌種，大致可以分為以下4個步驟：采樣、增殖培養(yǎng)、純種分離和性能測定〔5-6〕。土壤是微生物生活的大本營，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從中分離、純化得到期望中的菌株，再對菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，生產(chǎn)出所需的酶〔7〕。由于我國的α-淀粉酶制劑的品種和生產(chǎn)菌株都很單一，α-淀粉酶酶活力相對于國外同行業(yè)的較低〔8〕。本研究旨在從富含淀粉類物質(zhì)的土壤中分離純化出產(chǎn)α-淀粉酶的菌株，通過水解圈直徑和菌落直徑的比值，結(jié)合酶活力大小進(jìn)行比較，篩選出產(chǎn)酶活力較強(qiáng)的菌株，并對其所產(chǎn)的酶進(jìn)行初步的酶學(xué)性質(zhì)研究。研究結(jié)果可為α-淀粉酶的生產(chǎn)提供種質(zhì)資源，同時也為生產(chǎn)實踐提供數(shù)據(jù)支持和理論參考。

1 材料

1.1 樣品采集 土壤樣品分別采自大理學(xué)院校園面食食堂附近空地、晾曬谷物空地、食堂附近綠化帶和洗碗池旁，共4份，編號1～4。

1.2 培養(yǎng)基的制備

1.2.1 淀粉瓊脂培養(yǎng)基 2.0 g可溶性淀粉，10 g蛋白胨，5 g牛肉膏，5 g NaCl，加少量蒸餾水加熱溶解，然后稱量16 g瓊脂加入燒杯中溶化，補(bǔ)蒸餾水至1000 mL，再用1 mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl，調(diào)節(jié) pH 至6.4〔9〕。

1.2.2 產(chǎn)α-淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基 22.5 g面粉、10 g牛肉膏、2 g NaNO3、1.5 g K2HPO4、0.5 g MgSO4、0.005 g FeS04·7H2O，補(bǔ)蒸餾水至500 mL〔10〕。

2 方法

2.1 α-淀粉酶產(chǎn)生菌的分離 在超凈工作臺上，各稱取土樣10 g，分別加入到裝有90 mL無菌水的滅菌三角瓶中，震蕩搖勻，置80℃水浴10 min，以倍比稀釋法分別制備10-4～10-6稀釋度的土壤懸液。用移液管從10-4、10-5、10-6這3個梯度的試管中取土壤懸液1 mL注入無菌培養(yǎng)皿中，然后加入適量經(jīng)過滅菌融化的淀粉瓊脂培養(yǎng)基，搖勻、冷卻、標(biāo)記后，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h〔9〕。待長出菌落后，將新碘標(biāo)準(zhǔn)液加入到生長最好的平板中，菌落周圍若形成水解圈，便是產(chǎn)α-淀粉酶的菌株，測量這些菌株的菌落直徑和水解圈直徑，記錄編號。挑取有水解圈的單菌落，轉(zhuǎn)接平板，得到純種，繼續(xù)轉(zhuǎn)接于平板和試管斜面，37℃培養(yǎng)24 h后置4℃冰箱保藏，作為工作菌株備用。

2.2 α-淀粉酶的酶活力測定

2.2.1 發(fā)酵培養(yǎng) 找出每種菌株生長最好的稀釋度平板，將該稀釋度平板制成菌懸液。以接種量為4 mL，接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，最適發(fā)酵初始pH值為7，裝液量為40 mL。發(fā)酵溫度為33.5℃，搖床培養(yǎng)72 h，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)〔11〕。

2.2.2 原酶液的制備 首先，采用硫酸銨沉淀法從發(fā)酵液中粗提取α-淀粉酶〔12〕。全部操作過程均在室溫下進(jìn)行。每種菌株發(fā)酵液以4000 rmp離心10 min去菌體，所得上清液為粗酶液。粗酶液各取5 mL，分別同時加入1.87 g（NH4）2SO4細(xì)粉末，混勻，靜置30 min。以4000 rmp離心10 min，離心去除上清液保留沉淀，將沉淀在40℃下烘干，制成酶粉。再將0.1 g酶粉溶于1 mL無菌水，制成原酶液。

2.2.3 酶活力的測定 反應(yīng)體系為5 mL 0.5%淀粉和0.5 mL稀釋了200倍的原酶液，pH值6.0，50℃下反應(yīng)5 min后，加0.1 mol/L H2SO45 mL終止反應(yīng)，取0.5 mL反應(yīng)液加入5 mL Lugol氏碘液稀釋液，溶液顯色，在660 nm波長下測吸光度。查看吸光度與α-淀粉酶酶濃度對照表〔13〕，找出相應(yīng)測試酶液的濃度，通過下面公式計算出樣品的酶活力。

公式：X=cn，

式中：X為樣品的酶活力〔U/g（U/mL）〕，

c為測試酶液的濃度（U/mL），

n為樣品的稀釋倍數(shù)。

2.3 α-淀粉酶產(chǎn)生菌的形態(tài)學(xué)觀察 將產(chǎn)酶活力最強(qiáng)的菌株接種于淀粉瓊脂培養(yǎng)基〔9〕，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察菌落的形態(tài)特征，并通過革蘭氏染色和芽孢染色法對菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定〔14〕。

2.4 α-淀粉酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 α-淀粉酶最適反應(yīng)溫度 分別取制備好的產(chǎn)酶活力最強(qiáng)菌株的發(fā)酵液5 mL，在溫度梯度為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的情況下測定酶活力，以確定α-淀粉酶最適反應(yīng)溫度。

2.4.2 酶反應(yīng)最適pH值 反應(yīng)體系的pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的緩沖液，再將0.1%可溶性淀粉作為底物，加入5 mL制備好的產(chǎn)酶活力最強(qiáng)菌株的發(fā)酵液反應(yīng)5 min，測定酶活力，以確定該酶反應(yīng)最適pH值。

3 結(jié)果

3.1 α-淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選 從土壤樣品共分離到4株α-淀粉酶產(chǎn)生菌，水解圈測定結(jié)果見表1。由表1可見，菌株4的內(nèi)外徑比值較大，為2.800。

表1 菌株水解圈直徑比較

3.2 α-淀粉酶的酶活力測定 菌株1～4的酶活力測定結(jié)果見表2。從表2可知，菌株4產(chǎn)酶活力最高。

表2 酶活力的計算結(jié)果

3.3 菌株4形態(tài)學(xué)特征 菌株4的菌落表面光滑，不透明，呈規(guī)則的圓形。菌體經(jīng)革蘭氏染色呈桿狀，為革蘭氏陽性菌。經(jīng)芽孢染色后菌體中可見綠色芽孢，故初步鑒定菌株4為芽孢桿菌。

3.4 α-淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)

3.4.1 菌株4產(chǎn)α-淀粉酶酶促反應(yīng)最適溫度 結(jié)果見圖1。由圖1可知，菌株4產(chǎn)α-淀粉酶酶促反應(yīng)最適溫度范圍為50～60℃

圖1 α-淀粉酶熱穩(wěn)定性

3.4.2 菌株4產(chǎn)α-淀粉酶酶促反應(yīng)最適pH值 結(jié)果見圖2。由圖2可知，菌株4產(chǎn)α-淀粉酶酶促反應(yīng)適合pH值范圍在4.0～7.5之間，最適pH值為6.2。

圖2 不同pH值反應(yīng)體系中對酶活力的影響

4 討論

菌株4所產(chǎn)酶的酶活力最強(qiáng)，其所在土壤表層含淀粉類物質(zhì)最多，水分充足。推測這樣的土壤適合產(chǎn)淀粉酶活力較強(qiáng)的菌株的生長。

在測定α-淀粉酶酶活力時常采用白瓷板目視比色法。該方法是以酶與淀粉的呈色反應(yīng)為基礎(chǔ)，肉眼觀察酶反應(yīng)的終點，直接根據(jù)公式計算酶活力。雖然此方法簡便快速，但是在確定反應(yīng)終點時，由于主觀因素的影響會造成誤差，并且標(biāo)準(zhǔn)色的不穩(wěn)定性以及色澤與反應(yīng)液的不一致，都將影響酶活力最終計算結(jié)果。因此，本實驗在測定α-淀粉酶酶活力時均采用分光光度計法，此方法克服了白瓷板目視比色法的各種缺點。同時應(yīng)用（NH4）2SO4鹽析法，粗提取α-淀粉酶，將該酶稀釋200倍，吸光度便調(diào)整到了0.178～0.425范圍內(nèi)，可以查看吸光度與α-淀粉酶酶濃度對照表〔14〕，計算酶活力，這樣更準(zhǔn)確可靠。

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