尹志永 王興波 陳麗娜 任士俊 趙 金 楊大勇

1.河北省秦皇島市第二醫(yī)院胸外科，河北秦皇島 066600；2.河北省秦皇島市第二醫(yī)院病理科，河北秦皇島 066600；3.河北省秦皇島市第二醫(yī)院麻醉科，河北秦皇島 066600

近年來，世界各國(guó)肺癌的發(fā)病率和病死率均呈上升趨勢(shì)，在多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家，肺癌被列為惡性腫瘤死因的第1位。近70%非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者在確診時(shí)已經(jīng)是晚期，而外科手術(shù)切除后3年生存率仍較低[1]。肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移仍是死亡的主要原因，也是目前治療的難點(diǎn)。本文通過檢測(cè)NSCLC組織中金屬蛋白酶9（MMP9）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)情況，探討MMP9、EGFR、VEGF與肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，并應(yīng)用生存分析的方法來分析影響病情及療效的若干暴露因素的作用大小和方向，對(duì)判斷其惡性程度和估計(jì)預(yù)后具有一定的指導(dǎo)意義，也是臨床醫(yī)學(xué)研究中較先進(jìn)的研究手段。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取河北省秦皇島市第二醫(yī)院 （以下簡(jiǎn)稱 “我院”）2008年1月～2009年12月手術(shù)切除且經(jīng)常規(guī)病理證實(shí)的NSCLC標(biāo)本40例作為NSCLC組，其中男22例，女18例，年齡30～76歲，中位年齡62歲。良性肺組織標(biāo)本10例（炎性假瘤7例及結(jié)核球3例）作為對(duì)照組，其中男6例，女4例，年齡45～74歲，中位年齡67歲。在性別、年齡方面NSCLC組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 NSCLC組中有吸煙史（吸煙總量≥100支/年）24例，無吸煙史16例；腺癌34例，鱗癌5例，未分化癌1例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例；生存時(shí)間＜3年28例，≥3年12例；采用國(guó)際抗癌聯(lián)盟2009年修訂的肺癌分期標(biāo)準(zhǔn)[2]進(jìn)行分期，其中Ⅰ期6例，Ⅱ期20例，Ⅲ期14例。80%的患者術(shù)后予以鉑類為基礎(chǔ)的2～4個(gè)療程的化療。納入的病例要求切緣陰性，術(shù)后生存期3個(gè)月以上。隨訪截止時(shí)間為2013年1月。隨訪率為100%。

1.2 方法

手術(shù)切除的肺癌組織于10%中性甲醛溶液固定12 h后取材，自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片 4 μm 厚，60℃烤片 2 h，經(jīng)二甲苯-梯度乙醇脫蠟，自來水沖洗，短暫入蒸餾水待做免疫組化。免疫組化試劑盒采用MAXvision二步法，抗體選用MMP9、EGFR、VEGF單抗、二氨基聯(lián)苯酸（DAB）顯色劑，免疫組化試劑均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。根據(jù)每種抗體要求，進(jìn)行相應(yīng)的抗原修復(fù)，PBS沖洗3次×3 min，每張切片滴加50 μL正常非免疫動(dòng)物血清，37℃孵育[3]。除去血清，每切片滴加50 μL一抗，37℃孵育 60 min，PBS液沖洗 3次×3 min后，滴加 50 μL生物素標(biāo)記的二抗 （MAXvision），37℃孵育15 min，PBS液沖洗3次×3 min，新鮮配制的DAB液顯色，蘇木精復(fù)染，封片后顯微鏡下觀察。

1.3 結(jié)果判定

采用單盲法閱片，顯色部位應(yīng)正確，無背景顯色。MMP9抗原存在于惡性腫瘤細(xì)胞及其周圍血管內(nèi)皮細(xì)胞和增生的纖維母細(xì)胞的胞漿中；EGFR抗原是一種轉(zhuǎn)膜蛋白，存在于惡性細(xì)胞胞漿內(nèi)；VEGF抗原可誘導(dǎo)血管新生，存在于腫瘤細(xì)胞漿內(nèi)。因此，MMP9胞漿顯色、EGFR胞漿/胞膜顯色、VEGF胞漿顯色，顏色為棕黃色。腫瘤細(xì)胞無顯色為“-”，顯色細(xì)胞數(shù)＜20%為+，20%～50%為++，＞ 50%及以上為+++。 其中“++”和“+++”為高表達(dá)，“-”和“+”為低表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，生存分析的比較用Kaplan-Meier生存曲線，影響遠(yuǎn)期療效的相關(guān)因素分析采用Cox多因素回歸分析法，所有檢驗(yàn)和P值均為雙側(cè)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DAB染色

對(duì)照組：固有層中以淋巴細(xì)胞為主，MMP9、EGFR、VEGF蛋白較少，形態(tài)較規(guī)則，體積較小。見圖1。

NSCLC組MMP9、EGFR、VEGF的表達(dá)位于細(xì)胞漿。見圖2。

圖1 相關(guān)蛋白在對(duì)照組中的表達(dá)情況（DAB，100×）

圖2 相關(guān)蛋白在非小細(xì)胞癌組中的表達(dá)情況（DAB，100×）

2.2 MMP9、EGFR、VEGF在NSCLC組及對(duì)照組中的表達(dá)

MMP9、EGFR、VEGF在NSCLC組織中表達(dá)率分別為 65%（26/40）、50%（20/40）、55%（22/40）， 顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 MMP9、EGFR、VEGF蛋白的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的關(guān)系

40例NSCLC患者從手術(shù)日期開始隨訪，至患者死亡結(jié)束，未死亡的至2013年1月截止。用Kaplan-Meier生存分析，MMP9、EGFR、VEGF蛋白陽性表達(dá)組與陰性表達(dá)組在非小細(xì)胞肺癌患者3年生存率相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），三種蛋白均陽性表達(dá)者，預(yù)后最差。見圖3。

表1 非小細(xì)胞肺癌及肺良性病變組織中MMP9、EGFR、VEGF的表達(dá)水平[n（%）]

圖3 3種蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中陽性表達(dá)組與陰性表達(dá)組患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.4 非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后遠(yuǎn)期療效影響因素的分析

以遠(yuǎn)期療效為因變量，年齡、病程、病理分期、有無吸煙史、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等為自變量進(jìn)行Cox多因素回歸分析。結(jié)果表明，遠(yuǎn)期療效與年齡、病程、病理分期、吸煙史、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P<0.05）。見表2。

表2 非小細(xì)胞肺癌危險(xiǎn)因素的Cox多因素回歸分析

3 討論

MMP9是一類鋅離子依賴的、催化細(xì)胞外基質(zhì)降解的重要蛋白水解酶，能夠破壞局部組織結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)；破壞基質(zhì)屏障，利于腫瘤轉(zhuǎn)移；通過對(duì)ECM的改建，促進(jìn)腫瘤新生血管的形成。Laak等[4]研究顯示，肺癌細(xì)胞確實(shí)能分泌大量MMP9和VEGF，促進(jìn)腫瘤血管生成，提供腫瘤生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)條件，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。鄭先杰等[5]研究表明MMP9在腺癌組織中表達(dá)最高，在癌旁組織表達(dá)較弱，在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中表達(dá)增高。本研究結(jié)果顯示，MMP9在NSCLC組織中的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，Ⅲ期組明顯高于Ⅰ＋Ⅱ期組。提示MMP9的高表達(dá)與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

EGFR通過其細(xì)胞外區(qū)域與配體EGF、TNF-α等結(jié)合后，引起一系列的生物效應(yīng)，在正常組織中調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂等重要生理過程，是細(xì)胞增殖、黏附、分化等過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在癌組織中EGFR的高表達(dá)可以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和新生心血管的形成，促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[6-7]。王立波等[8]研究表明EGFR在非小細(xì)胞肺癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于正常組織，且與分化程度、TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究結(jié)果與報(bào)道基本一致，EGFR在NSCLC組織中的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或TNM分期較晚的患者組織中呈高表達(dá)，提示EGFR的高表達(dá)促進(jìn)了癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，加速了癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。VEGF是一組生長(zhǎng)因子，主要由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，小部分來自細(xì)胞間質(zhì)，能促進(jìn)新血管的形成和發(fā)育。血管形成在腫瘤生長(zhǎng)、侵潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，受到一系列促進(jìn)和抑制因子的調(diào)節(jié)，其中最重要的促進(jìn)因子之一就是腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中分泌的VEGF。胡雅兵[9]報(bào)道VEGF在非小細(xì)胞肺癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常對(duì)照組織，且與分化程度、TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF在NSCLC組織中的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，Ⅲ期組顯著高于Ⅰ＋Ⅱ期組，說明VEGF也是NSCLC發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的一個(gè)重要因子，Yoshida等[10]的研究結(jié)果也支持這一觀點(diǎn)。

MMP9、EGFR和VEGF因其自身所具備的一些特異性，使其應(yīng)用價(jià)值得到明顯提高，因此，近來受到國(guó)外腫瘤學(xué)領(lǐng)域?qū)W者的廣泛關(guān)注。其特點(diǎn)及應(yīng)用范圍可歸納為兩大類：①由于MMP9、EGFR和VEGF在非小細(xì)胞肺癌的特異性表達(dá)，使其有望成為非小細(xì)胞肺癌的診斷和預(yù)后判定新標(biāo)志；②有望成為抗瘤體新靶標(biāo)，開拓腫瘤間質(zhì)治療新途徑。這是因?yàn)镸MP9、EGFR和VEGF基因組較穩(wěn)定，抗原丟失和治療耐受的概率較?。籑MP9、EGFR和VEGF是僅在局部表達(dá)的膜分子，不能分解為可溶性產(chǎn)物進(jìn)入血液循環(huán)，保證了腫瘤局部存在豐富的MMP9、EGFR和VEGF靶標(biāo)[11]。目前，國(guó)外在上述兩個(gè)方面的研究均取得較大進(jìn)展，如已將鼠MMP9、EGFR和VEGF單克隆抗體F19用于臨床診斷，應(yīng)用另一MMP9、EGFR和VEGF抗體BIBH1對(duì)非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行治療，效果明顯（Ⅱ期臨床研究）[12]。 經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，MMP9、EGFR、VEGF 在NSCLC組中的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。MMP9、EGFR、VEGF陽性表達(dá)率越高，生存時(shí)間越短。提示MMP9、EGFR與VEGF參與NSCLC的發(fā)生和發(fā)展，并起協(xié)同作用。影響NSCLC患者術(shù)后遠(yuǎn)期療效的相關(guān)因素較多，與患者的年齡、病理分期、病程、吸煙史、淋包括巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

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