呂國偉 朱繼 籍新潮 萬偉峰 徐睿

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，重慶 400016）

目前，越來越多的研究［1］表明，蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）對早期腦損傷（early brain injury，EBI）的發(fā)展起重要作用，尤其是SAH后急性腦血管痙攣（cerebral vasospasm，CVS）的發(fā)生及痙攣程度與患者病情進(jìn)展的嚴(yán)重程度及其預(yù)后密切相關(guān)。引起早期急性CVS的病理因素有很多，如紅細(xì)胞破壞后釋放血紅蛋白、內(nèi)皮細(xì)胞受損后一氧化氮釋放減少、血管壁炎性反應(yīng)、血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)皮素受體激活、血管平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等，但其具體機(jī)制仍不明確［2－6］。含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶（a disintegrin－like and metalloproteinase with thrombospondin type 1motifs，ADMTS－1）是一種新近發(fā)現(xiàn)的基質(zhì)金屬蛋白酶。研究［7］發(fā)現(xiàn)，ADAMTS－1與神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，有望成為多種神經(jīng)損傷的標(biāo)志蛋白及藥物治療靶點(diǎn)。本課題通過研究大鼠SAH后早期基底動脈中ADAMTS－1的表達(dá)及其與CVS的關(guān)系，探討ADAMTS－1在SAH后EBI中的作用。

1 資料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動物與主要試劑 健康成年雄性SD大鼠108只，體質(zhì)量250～300g，隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham組，n＝18）和SAH 組（n＝90）。SAH 組隨機(jī)分為SAH 6h、12h、24h、48h、72h5個亞組，每個亞組各18只。sham組及SAH組各亞組中的6只SD大鼠用來檢測基底動脈 ADAMTS－1的mMRA表達(dá)，6只用來檢測ADAMTS－1蛋白表達(dá)，6只用來測量基底動脈管徑及管壁厚度。ADAMTS－1抗體購自美國Santa Cruz公司；Trizol試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）檢測試劑盒購自日本Takara公司。

1．2 建立SAH模型 根據(jù)文獻(xiàn)［8］報(bào)道，采用改良的視交叉池注血法建立大鼠SAH模型。用3．5%水合氯醛（10mL／kg）將大鼠麻醉后，將其固定于腦立體定向儀，局部剪毛消毒后沿顱頂正中矢狀線切開皮膚，鈍性分離肌肉及骨膜后在冠狀縫前5．0cm、中線旁開3．0cm處，用牙科鉆鉆孔。顯露額極，以4號針頭挑破硬腦膜，見清亮腦脊液流出時(shí)，將PE10導(dǎo)管尖端從額極緊貼前顱窩底蛛網(wǎng)膜下腔向雙耳連線中點(diǎn)送入約10mm。經(jīng)大鼠股動脈抽取自體動脈血300 μL，經(jīng)PE10導(dǎo)管15s內(nèi)緩慢注入，拔出導(dǎo)管，以骨蠟封閉骨孔，縫合頭皮并消毒后維持頭低位30min。sham組大鼠按以上方法操作，但在視交叉池內(nèi)注入等量0．9%氯化鈉液。

1．3 檢測大鼠基底動脈 ADAMTS－1mRNA 按Trizol試劑盒說明書提取基底動脈總RNA。采用兩步法RT－PCR試劑盒配置反應(yīng)體系。ADAMTS－1及3－磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）引物均由日本Takara公司設(shè)計(jì)并合成。ADAMTS－1上游引物為gataagtgtggcgtttgtggag，下 游 引 物 為 gatggtcaggggttctttgagt，擴(kuò)增片段長度為336bp。內(nèi)參照GAPDH上游引物為gtgctgagtatgtcgtggagtct，下游引物為gtggaagaatgggagttgctgt，擴(kuò)增片段長度為610bp。將RT－PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下攝照，比較電泳條帶相對光密度值。

1．4 提取基底動脈蛋白 SAH各亞組大鼠于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)、sham組大鼠于72h迅速斷頭取腦，分離基底動脈并置于液氮保存。之后，取出基底動脈，將其置于1．5mL EP管中，加入全細(xì)胞蛋白裂解液后用電動勻漿器吹打5s，然后于4℃以12 000r／min離心5min，收集上清液，保存于－80℃冰箱中備用。

1．5 蛋白質(zhì)印跡（Western－blot）法及 RT－PCR法檢測基底動脈ADAMTS－1蛋白及mRNA的表達(dá) 按常規(guī)方法進(jìn)行

1．6 基底動脈組織形態(tài)學(xué)觀察 分別在基底動脈大腦后動脈處、基底動脈中段、椎動脈匯合處取材，制成5μm厚度切片，進(jìn)行HE染色。觀察基底動脈形態(tài)變化，參考文獻(xiàn)［9］中的方法分別計(jì)算3個層面的管腔直徑，取其平均值；在高倍鏡（10×40）下測量基底動脈管壁厚度，取3個層面的平均值。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著差數(shù)法檢驗(yàn)（least significant difference，LSD）。變量之間采用Pearson相關(guān)分析檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)ɑ＝0．05。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 大鼠基底動脈ADAMTS－1mRNA表達(dá) 與sham組相比較，SAH 6h亞組大鼠基底動脈ADAMTS－1的mRNA表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0．24）；SAH 12h亞組大鼠基底動脈 ADAMTS－1mRNA表達(dá)增高（P＝0．008）；SAH 24h亞組基底動脈 ADAMTS－1mRNA 表 達(dá) 達(dá)到高峰 （P＝0．003）；SAH 48h 亞組基底 動脈 ADAMTS－1的mRNA表達(dá)較SAH 24h亞組開始下降（P＝0．005）；72h亞組基底動脈 ADAMTS－1mRNA 表達(dá)降至最低（P＝0．007），見圖1。

圖1 sham組及SAH各亞組大鼠基底動脈ADAMTS－1mRNA表達(dá)水平比較

2．2 大鼠基底動脈 ADAMTS－1蛋白表達(dá) 與sham組相比較，SAH 6h亞組大鼠基底動脈ADAMTS－1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0．266）；SAH 12h亞組大鼠ADAMTS－1蛋白表達(dá)開始升高（P＝0．007），24h亞組達(dá)到高峰（P＝0．003），在48h亞組開始下降（P＝0．005），72h亞組仍維持在較高水平（P＝0．008），見圖2～3。

2．3 大鼠基底動脈光鏡下的形態(tài)學(xué)觀察sham組大鼠基底動脈內(nèi)膜光滑完整，無褶皺。與sham組大鼠相比較，SAH 6h亞組大鼠基底動脈管壁厚度和管腔直徑的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（管壁厚度P＝0．302；管腔直徑P＝0．233）；SAH 12h亞組大鼠基底動脈內(nèi)膜開始出現(xiàn)褶皺，管壁增厚（P＝0．006），管腔縮小（P＝0．004）；24h亞組大鼠基底動脈痙攣?zhàn)蠲黠@，內(nèi)膜明顯皺縮，管壁顯著增厚（P＝0．002），管腔顯著變?。≒＝0．001）；48h亞組大鼠基底動脈內(nèi)膜皺縮減輕，管腔較24h亞組增大（P＝0．007），管壁較24h亞組變?。≒＝0．006）；72h亞組大鼠基底動脈內(nèi)膜未見明顯褶皺，管壁進(jìn)一步變?。≒＝0．009），管腔顯著增大（P＝0．007），見圖4～6。

圖2 Western－blot顯示大鼠基底動脈ADAMTS－1蛋白表達(dá)水平

圖3 sham組及SAH各亞組大鼠基底動脈ADAMTS－1蛋白表達(dá)比較

圖4 sham組及SAH組各亞組大鼠基底動脈形態(tài)學(xué)比較

圖5 sham組及SAH各亞組大鼠基底動脈校正管腔直徑（μm）比較

圖6 sham組及SAH各亞組大鼠基底動脈校正管壁厚度（μm）比較

2．4 SAH后早期基底動脈ADAMTS－1蛋白表達(dá)與急性CVS的關(guān)系 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，大鼠SAH后早期基底動脈ADAMTS－1蛋白表達(dá)與急性CVS呈正相關(guān)（r＝0．916，P＝0．003）。

3 討 論

自發(fā)性SAH是發(fā)病率及死亡率均較高的急性出血性腦血管綜合征，50%以上是由顱內(nèi)動脈瘤破裂引起，又稱動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血。再出血及SAH后遲發(fā)性腦血管痙攣（delayed cerebral vasospasm，dCVS）而導(dǎo)致的遲發(fā)性缺血性神經(jīng)功能障礙（delayed ischemic neurological deficits，DIND）是導(dǎo)致患者死亡或殘疾的最主要原因。尼莫同等鈣離子拮抗劑及內(nèi)皮素受體抑制劑的應(yīng)用雖能明顯緩解CVS，但不能降低aSAH患者的死亡率。Cahill等［10］匯總大量的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SAH后EBI的發(fā)生及嚴(yán)重程度在很大程度上影響SAH患者的預(yù)后。SAH后急性CVS可導(dǎo)致腦血流量（cerebral blood flow，CBF）急劇下降，腦灌注壓也隨之降低，大腦發(fā)生局部或彌漫性的缺血、缺氧性改變，這在EBI的病理過程中起著重要的作用。ADAMTS－1與ADAMTS家族其他成員一樣，具有血小板反應(yīng)素基序（thrombospondin，TSP），屬于分泌型蛋白，其被分泌后可通過C末端3個TSP重復(fù)序列和間隔區(qū)錨定在細(xì)胞外基質(zhì)中，并通過降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白參與多種病理生理過程。研究［11］發(fā)現(xiàn)，ADAMTS－1能夠酶解血管基質(zhì)蛋白，促進(jìn)血管平滑肌的增殖和移位，從而參與動脈血管壁的損傷；另外，ADAMTS－1還可通過其C－末端與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長 因 子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）的肝素區(qū)結(jié)合，進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，影響血管收縮與舒張功能的調(diào)節(jié)。目前，國內(nèi)外關(guān)于ADAMTS－1與腦血管疾病的研究尚不多。Crossa等［12］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠大腦中動脈短暫閉塞后，星形膠質(zhì)細(xì)胞中ADAMTS－1mRNA表達(dá)升高；而且腫瘤壞死 因子－α（tumor necrosis factor－alpha ，TNF－α）等炎性反應(yīng)介質(zhì)可上調(diào)ADAMTS－1在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，加速細(xì)胞外基質(zhì)的降解，促使神經(jīng)細(xì)胞從基膜脫落、凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，與sham組相比，SAH后6h大鼠基底動脈 ADAMTS－1mRNA含量及 ADAMTS－1蛋白表達(dá)無顯著差異；SAH后12h基底動脈ADAMTS－1mRNA含量及ADAMTS－1蛋白表達(dá)顯著升高，于24h達(dá)到高峰，48h開始下降，72h仍高于sham組水平。同時(shí)，與sham組比較，SAH后6h大鼠基底動脈形態(tài)無顯著變化；SAH后12h大鼠基底動脈管徑變小，管壁增厚，內(nèi)膜呈波浪狀改變；24h大鼠基底動脈痙攣?zhàn)蠲黠@，內(nèi)皮細(xì)胞部分脫落，內(nèi)膜明顯皺縮；48h大鼠基底動脈管腔較24h增大，管壁變薄，內(nèi)膜皺縮減輕；72h大鼠基底動脈管徑顯著增大，管壁進(jìn)一步變薄，內(nèi)膜皺縮明顯減輕。SAH后早期大鼠基底動脈中ADAMTS－1的表達(dá)與急性CVS呈正相關(guān)，提示SAH后ADAMTS－1參與大鼠基底動脈早期急性CVS的發(fā)生，但其具體病理機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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