張立凡 劉特

（1．復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院胸外科，上海 200040；2．上海中醫(yī)老年醫(yī)學(xué)研究所，上海 200031）

肺癌組織中存在耐藥性和自我增殖能力都非常強(qiáng)的腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）亞群，該亞群是肺癌細(xì)胞耐藥和肺癌治療后復(fù)發(fā)的主要原因之 一［1－2］。成纖維細(xì)胞激活蛋白 （fibroblast activation protein，F(xiàn)AP）家族包括 FAP1、FAP2 和FAP3，屬于Ⅱ型膜整合糖蛋白、絲氨酸蛋白酶家族。FAP具有體外二肽肽酶和膠原酶活性，可選擇性地表達(dá)于95%以上的肺癌間質(zhì)成纖維細(xì)胞中，但是至今未見其表達(dá)于正常的成纖維組織和細(xì)胞的報(bào)道，F(xiàn)AP家族成員可能是增生性成纖維細(xì)胞的表面標(biāo)志物［3－4］。研究siRNA靶向抑制肺癌CSCs中FAP3的表達(dá)，期盼闡明其對肺癌CSCs增殖和侵襲的影響。

1 資料與方法

1．1 細(xì)胞及主要試劑 人肺癌細(xì)胞株A549和siRNA－FAP質(zhì)粒由復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供。四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、核糖核酸酶A（ribonuclease A，RNase A）購自美國Sigma公司。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國 Gibco公司。兔抗人CD44－異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）抗體、兔抗人CD133－藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）抗體、兔抗人Ki67抗體及兔抗人3－磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體購自美國CST公司。Trizol Reagent購自美國Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購自東洋紡（上海）生物科技有限公司。山羊血清、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司。蛋白質(zhì)印跡（Western blot）試劑盒購自迪申生物（上海）有限公司。

1．2 肺癌CSCs篩選與培養(yǎng) 參考Gao［5］的方法，將A549細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基（內(nèi)含10%FBS、青霉素100U／mL、鏈霉素100U／mL）于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。選取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，用0．25% 胰蛋白酶－EDTA消化液消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，分別加入2μL兔抗人CD44－FITC抗體和2μL兔抗人CD133－PE抗體，4℃孵育30min，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗1次，并重懸細(xì)胞。取500 μL細(xì)胞懸液（調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107／mL），用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選，并收集CD44＋／CD133＋的肺癌CSCs。將肺癌CSCs分為3組：空白對照組（不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒）；siRNA－FAP組（轉(zhuǎn)染靶向沉默F(xiàn)AP3表達(dá)的siRNA質(zhì)粒）；陰性對照組（轉(zhuǎn)染包含隨機(jī)序列的siRNA質(zhì)粒）。

1．3 MTT比色法檢測CSCs增殖 將空白對照組、陰性對照組和siRNA－FAP組細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（2×103個(gè)／孔），置于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，并分別于轉(zhuǎn)染12、24、48和72h后進(jìn)行檢測。在檢測前4h加入MTT 20μL（5mg／L），繼續(xù)培養(yǎng)4h。離心去上清液并加入DMSO溶解沉淀。用酶標(biāo)儀在490nm波長處讀取吸光度（OD值），設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，取其平均值。借以各孔的OD值，計(jì)算出siRNA對肺CSCs的增殖抑制率。

1．4 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）法檢測FAP3、Ki67的mRNA表達(dá)水平 按照Trizol Reagent說明書的步驟，抽提各組細(xì)胞的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以各組cDNA作為模板，采用兩步法進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。各樣本重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，以18SrRNA作為內(nèi)參。目標(biāo)片段的擴(kuò)增引物序列為：Ki67上游引物5’－TGGGTCTGTTATTGATGAGCC－3’；Ki67 下游 引 物 5’－TGACTTCCTTCCATTCTGAAGAC－3’；FAP3上游引物5’－TCAGTGTGAGTGCTCTCATTGTAT－3’；FAP3 下 游 引 物 5’－GCTGTGCTTGCCTTATTGGT－3’；18SrRNA上游引物5’－CGTTGATTAAGTCCCTGCCCTT－3’；18SrRNA 下游 引 物 5’－TCAAGTTCGACCGTCTTCTCAG－3’。兩步法中退火溫度為58℃，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為40個(gè)。

1．5 Western blot檢測蛋白表達(dá)量 于轉(zhuǎn)染72h后收集各組細(xì)胞，根據(jù)Western blot試劑盒說明書操作，采用BandScan軟件分析各條帶的灰度值。

1．6 軟瓊脂克隆集落形成實(shí)驗(yàn)檢測肺癌CSCs的侵襲能力 在42℃水浴中，將貯存濃度為1．2%的低熔點(diǎn)瓊脂糖與細(xì)胞完全培養(yǎng)基（濃度為原始培養(yǎng)基的2倍）等體積混合，形成終濃度為0．6%的底層瓊脂，取1．4mL加入6孔板的1個(gè)孔中。待瓊脂完全凝固后，取對數(shù)期細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104／mL。再將貯存濃度為0．6%的低熔點(diǎn)瓊脂糖與細(xì)胞完全培養(yǎng)基（濃度為原始培養(yǎng)基的2倍）等體積混合，形成終濃度為0．3%的上層瓊脂。取1．0mL上層瓊脂與0．1mL細(xì)胞懸液充分混勻，加入已有下層瓊脂的6孔板中，待其凝固后，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3周，計(jì)算細(xì)胞克隆集落形成率。

2 結(jié) 果

2．1 靶向FAP3表達(dá)的siRNA對肺癌CSCs體外增殖的影響 見表1。

表1 MTT比色法檢測細(xì)胞增殖抑制率（%，±s）

表1 MTT比色法檢測細(xì)胞增殖抑制率（%，±s）

注：與其他2組相應(yīng)培養(yǎng)時(shí)間時(shí)的細(xì)胞增殖抑制率比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01

轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)時(shí)間（h）空白對照組（n＝6）siRNA－FAP3組（n＝6）陰性對照組（n＝6）0 0 0 0 12 1．26±0．06 2．59±0．13 0．23±0．18 24 1．22±0．15 5．89±0．29 1．79±0．37 48 2．34±0．41 24．67±1．08＊ 3．76±0．88 72 3．28±0．65 53．98±3．75＊＊4．53±1．01

2．2 siRNA抑制FAP3及增殖相關(guān)基因的mRNA表達(dá) 各組細(xì)胞培養(yǎng)72h后，siRNA－FAP組細(xì)胞中FAP3和Ki67基因mRNA的表達(dá)水平（0．32±0．06，0．18±0．02）顯著低于陰性對照組（1．03±0．12，0．99±0．17）和空白對照組（1．02±0．09，0．97±0．11），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。由此可見，siRNA可以有效地抑制細(xì)胞內(nèi)FAP3基因的表達(dá)，下調(diào)腫瘤增殖基因Ki67的轉(zhuǎn)錄。

2．3 siRNA對肺癌CSCs中增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 各組細(xì)胞培養(yǎng)72h后，siRNA－FAP組細(xì)胞中FAP3和 Ki67蛋白表達(dá)水平（0．16±0．05，0．25±0．09）顯著低于陰性對照組（0．49±0．26，0．47±0．13）和空白對照組（0．59±0．27，0．63±0．22），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見圖1。以上結(jié)果表明，siRNA可有效抑制CSCs內(nèi)FAP3蛋白的表達(dá)，下調(diào)腫瘤增殖基因Ki67蛋白的表達(dá)，從而抑制肺癌CSCs的體外增殖。

圖1 Western blot檢測Ki67和FAP3蛋白的表達(dá)

2．4 靶向FAP3的siRNA對肺癌CSCs侵襲的影響 將各組細(xì)胞以低密度接種于軟瓊脂培養(yǎng)基時(shí)，siRNA－FAP組 細(xì) 胞 的 克 隆 形 成 率 ［（13．09±5．21）%］顯著低于陰性對照組［（77．59±8．29）%］和空白對照組［（83．86±10．11）%］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。而陰性對照組與空白對照組細(xì)胞克隆形成率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。以上結(jié)果表明，靶向抑制FAP3的表達(dá)可以有效地削弱肺癌CSCs在體外基質(zhì)中的遷移與侵襲能力。

3 討 論

自從在淋巴瘤細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)CSCs以來，已經(jīng)在許多腫瘤組織（如肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等）中找到了CSCs。肺癌CSCs高表達(dá)CD44和CD133蛋白，且具有很強(qiáng)的化療藥物耐受性和自我增殖能力。另一方面，肺癌基質(zhì)成纖維細(xì)胞通過分泌一定的生長因子來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，為肺癌細(xì)胞的生長和浸潤提供了有利的條件。有研究［6］表明，F(xiàn)AP在多種惡性上皮性腫瘤的間質(zhì)中呈現(xiàn)高表達(dá)的態(tài)勢，其過度表達(dá)可以促進(jìn)局部腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移。Rettig等［6］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AP1和FAP2在核酸序列上與T細(xì)胞活化表面抗原CD26具有很高的同源性，但是其表達(dá)的部位與功能卻不盡相同。目前FAP3與腫瘤之間的關(guān)系尚不明了，對其的研究也尚少?；诖?，我們以肺癌CSCs作為研究對象，研究siRNA抑制FAP3基因的表達(dá)對肺癌CSCs的影響。結(jié)果表明，當(dāng)FAP3表達(dá)被顯著抑制后，肺癌CSCs的體外增殖速度明顯減緩，其侵襲性因此而阻滯。此外，當(dāng)FAP3基因表達(dá)受抑制之后，細(xì)胞增殖因子Ki67的表達(dá)顯著下調(diào)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說明，F(xiàn)AP3的表達(dá)對肺癌CSCs的增殖和侵襲具有顯著的影響，當(dāng)FAP3被抑制后，肺癌CSCs的自我增殖和轉(zhuǎn)移能力都會(huì)受到影響。

綜上所述，采用siRNA技術(shù)可以有效抑制肺癌CSCs中FAP3的表達(dá)，并抑制CSCs的惡性行為。

［1］ Lundin A，Driscoll B．Lung cancer stem cells：Progress and prospects［J］．Cancer Lett，2012，17（3）：239－245．

［2］ Nurwidya F，Murakami A，Takahashi F，et al．Lung cancer stem cells：tumor biology and clinical implications［J］．Asia Pac J Clin Oncol，2012，8（3）：217－222．

［3］ Brennen WN，Isaacs JT，Denmeade SR．Rationale behind targeting fibroblast activation protein－expressing carcinomaassociated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy［J］．Mol Cancer Ther，2012，11（2）：257－266．

［4］ Shi M，Yu DH，Chen Y，et al．Expression of fibroblast activation protein in human pancreatic adenocarcinoma and its clinicopathological significance［J］．World J Gastroenterol，2012，18（8）：840－846．

［5］ Gao Y，Liu T，Cheng W，et al．Isolation and characterization of proliferative，migratory and multidrug－resistant endometrial carcinoma－initiating cells from human typeⅡendometrial carcinoma cell lines［J］．Oncol Rep，2012，28（2）：527－532．

［6］ Rettig WJ，Su SL，F(xiàn)ortunato SR，et al．Fibroblast activation protein：purification，epitope mapping and induction by growth factors．Int J Cancer，1994，58（3）：385－392．