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        釓噴替酸葡甲胺對軟骨細(xì)胞凋亡及自噬的影響

        2021-06-04 05:15:12焦華杰王琰娟饒慧敏
        寧夏醫(yī)學(xué)雜志 2021年5期
        關(guān)鍵詞:劑量

        焦華杰,宋 濤,于 芝,王琰娟,饒慧敏

        隨著核磁共振(MR)技術(shù)的發(fā)展及其影像學(xué)診斷獨(dú)特的優(yōu)勢,目前MR在臨床的應(yīng)用越來越廣泛。釓噴替酸葡甲胺是常用的MR掃描對比劑,長期以來被認(rèn)為在推薦劑量下是安全的,然而越來越多的證據(jù)表明,釓并不能完全從體內(nèi)清除,一些釓劑持續(xù)存在于人體組織細(xì)胞中[1]。MR直接法關(guān)節(jié)造影在關(guān)節(jié)損傷診斷方面應(yīng)用廣泛[2],但對比劑釓噴替酸葡甲胺局部注射對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞是否會產(chǎn)生毒性影響,目前尚無文獻(xiàn)資料報(bào)道。本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討不同劑量釓噴替酸葡甲胺對人軟骨細(xì)胞的毒性及對人軟骨細(xì)胞凋亡及自噬的影響。

        1 資料與方法

        1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組:人軟骨細(xì)胞購自北納生物,細(xì)胞培養(yǎng)采用DMEM/F12培養(yǎng)基+10胎牛血清+1%雙抗(青霉素+鏈霉素),細(xì)胞每48h換液一次,細(xì)胞融合達(dá)到80%進(jìn)行傳代培養(yǎng),bcl2兔抗人蛋白抗體(12789-1-AP)、bax兔抗人抗體(50599-2-Ig)、lc3兔抗人抗體(14600-1-AP)、p62兔抗人抗體(18420-1-AP)、gapdh兔抗人抗體(10494-1-AP)購自武漢三鷹公司,cleaved-caspase3兔抗人抗體(9661)購自CST公司。實(shí)驗(yàn)依據(jù)加入藥物濃度分為正常對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組,各組細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入0 mmoL/L、0.5 mmoL/L、2 mmoL/L、10 mmoL/L釓噴替酸葡甲胺。

        1.2 CCK8細(xì)胞增殖檢測:取對數(shù)生長期軟骨細(xì)胞,接種到96孔板中,每孔104個細(xì)胞,分別加入對應(yīng)濃度藥物24 h 后,CCK8檢測各組細(xì)胞增殖率,每組重復(fù)3次。

        1.3 細(xì)胞凋亡率檢測:取對數(shù)生長期軟骨細(xì)胞,分別加入對應(yīng)濃度的釓噴替酸葡甲胺24h后,0.25%胰酶消化收集細(xì)胞,PBS離心洗滌3次(800 g,5 min,下同),75%乙醇固定30 min,PBS離心洗滌3次,加入500 μL凋亡檢測工作液。避光孵育30 min后流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率,每組重復(fù)3次。

        1.4 Western blot檢測:各組細(xì)胞,0.25%胰酶消化后,PBS離心洗滌3次,加入500 μL預(yù)配置好的細(xì)胞裂解液,冰上裂解5 min,震蕩10 s,反復(fù)操作5次,12 000 g離心15 min,收集上清,BCA法檢測蛋白濃度,加熱煮沸5 min,配制SDS凝膠,每組加入30 μg蛋白,110 V恒壓電泳,300 mA恒流轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉1 h,加入一抗工作液37 ℃孵育1 h(bcl2兔抗人抗體,1∶2 000;bax兔抗人抗體,1∶5 000;cleaved-caspase3兔抗人抗體,1∶1 000;lc3兔抗人抗體,1∶3 000;p62兔抗人抗體,1∶4 000;gapdh兔抗人抗體,1∶20 000),TBST洗膜3次,加入二抗( HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗,1∶10 000)工作液37 ℃孵育1 h,TBST洗滌3次,ECL發(fā)光檢測,采用ImageJ軟件進(jìn)行蛋白表達(dá)相對定量。

        2 結(jié)果

        2.1 CCK8細(xì)胞增殖檢測:各組細(xì)胞增殖檢測比較(F=7.350,P<0.05),組間兩兩比較低劑量組(1.01±0.04)與正常對照組細(xì)胞(0.99±0.06)增殖率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.507,P>0.05),中劑量組(0.97±0.05)與正常對照組細(xì)胞(0.99±0.06)增殖率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.144,P>0.05),高劑量組(0.86±0.015),與正常對照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.784,P<0.05)。

        2.2 各組細(xì)胞凋亡率檢測:正常對照組細(xì)胞凋亡率為(1.17±0.15)%,低劑量組為(1.27±0.16)%,中劑量組為(1.20±0.20)%,高劑量組為(5.01±0.25)%,四組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=297.44,P<0.05)。各組細(xì)胞凋亡率檢測比較,低劑量組、中劑量組細(xì)胞凋亡率與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),高劑量組與正常對照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        2.3 各組細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)相對定量比較:Western blot檢測各組細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá),低劑量組、中劑量組與正常對照組比較,bcl2、bax、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),高劑量組與正常對照組比較,bcl2蛋白表達(dá)下調(diào),bax、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

        表1 各組細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)相對定量比較

        2.4 各組細(xì)胞自噬蛋白表達(dá)比較:Western blot檢測各組細(xì)胞自噬蛋白表達(dá),低劑量組、中劑量組與正常對照組比較,lc3Ⅱ蛋白表達(dá)上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),p62蛋白表達(dá)下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高劑量組與正常對照組比較,lc3Ⅱ蛋白表達(dá)下調(diào),lc3 、p62蛋白表達(dá)上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

        表2 各組細(xì)胞自噬蛋白相對表達(dá)定量比較

        3 討論

        近年來MR關(guān)節(jié)造影在臨床應(yīng)用越來越多,相關(guān)研究表明MR 關(guān)節(jié)造影對半月板撕裂的敏感性和特異性有明顯提高,檢查結(jié)果更接近關(guān)節(jié)鏡[3]。MR關(guān)節(jié)造影分為直接法和間接法,直接法是先向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MR對比劑,然后通過MR掃描觀察關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)及病變。直接法膝關(guān)節(jié)MR造影可以通過擴(kuò)大分離關(guān)節(jié)囊,能夠更加清晰顯示關(guān)節(jié)內(nèi)部結(jié)構(gòu)及病變,同時(shí)對于某些膝關(guān)節(jié)病變,如評價(jià)術(shù)后半月板是否再次損傷、膝關(guān)節(jié)游離體、評價(jià)關(guān)節(jié)軟骨退變、剝脫等方面,MR膝關(guān)節(jié)直接造影具有很高的診斷價(jià)值[4]。

        釓噴替酸葡甲胺是常用的MR掃描對比劑,隨著研究的不斷深入,近年來關(guān)于釓增強(qiáng)劑應(yīng)用的安全性越來越受到關(guān)注[5],MR增強(qiáng)掃描后的組織細(xì)胞釓沉積對機(jī)體具有一定危害[6-7],同時(shí)有相關(guān)資料顯示釓可在細(xì)胞中長期存在[8-9]。有研究表明[10],小鼠孕期接受釓增強(qiáng)劑可同過胎盤沉積于幼鼠大腦組織,并對幼鼠腦發(fā)育產(chǎn)生影響。Beyazal Celiker F等研究表明臨床反復(fù)使用釓對比劑可使大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡增加,血清Ca2+水平升高,睪酮水平降低[11]。

        骨組成細(xì)胞包括軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的細(xì)胞死亡,在骨骼的發(fā)育、維持和修復(fù)以及骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。軟骨細(xì)胞的增殖、分化和凋亡是軟骨內(nèi)成骨的重要步驟,軟骨細(xì)胞通過產(chǎn)生各種酶、細(xì)胞因子和基質(zhì)相關(guān)蛋白來維持細(xì)胞外基質(zhì)在降解和修復(fù)之間的功能平衡[12],而廣泛的軟骨細(xì)胞死亡或功能障礙可導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷的進(jìn)一步發(fā)展[13]。為此,在關(guān)節(jié)損傷診斷治療過程中應(yīng)盡力保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞數(shù)量功能完整。

        目前國內(nèi)外常用釓噴替酸葡甲胺關(guān)節(jié)造影濃度為0.5 mmoL/L及2 mmoL/L[14],也有文獻(xiàn)資料表明可應(yīng)用到45 mmoL/L[15]。本次研究中通過比較不同濃度釓噴替酸葡甲胺對人軟骨細(xì)胞增殖、凋亡影響發(fā)現(xiàn),0.5 mmoL/L、2 mmoL/L釓噴替酸葡甲胺對軟骨細(xì)胞增殖及凋亡無影響,但可促進(jìn)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白lc3Ⅱ表達(dá),提高細(xì)胞自噬能力。10 mmoL/L釓噴替酸葡甲胺能夠抑制人軟骨細(xì)胞增殖及自噬,通過上調(diào)促凋亡蛋白bax、cleaved-caspase3蛋白表達(dá),抑制抗凋亡蛋白bcl2表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡。

        綜上所述,本次研究表明低濃度釓噴替酸葡甲胺能夠促進(jìn)人軟骨細(xì)胞自噬,而高濃度釓噴替酸葡甲胺能夠抑制人軟骨細(xì)胞增殖及自噬,促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡。雖然本次研究對釓噴替酸葡甲胺誘導(dǎo)人軟骨細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚未闡明,但本次研究結(jié)果為臨床改善釓噴替酸葡甲胺進(jìn)行MR關(guān)節(jié)造影提供了理論依據(jù),臨床醫(yī)師在進(jìn)行MR關(guān)節(jié)造影檢查時(shí)應(yīng)嚴(yán)格把控釓噴替酸葡甲胺對比劑濃度,避免高濃度對比劑帶來的二次損傷。

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