汪東劍，張曉云，江丁

(中國人民解放軍第一八四醫(yī)院檢驗科，江西鷹潭335000)

乳汁成分對乙型肝炎病毒DNA檢測的影響

汪東劍，張曉云，江丁

(中國人民解放軍第一八四醫(yī)院檢驗科，江西鷹潭335000)

目的探討乳汁成分對乙型肝炎病毒DNA（HBV-DNA）檢測的影響以及乙肝病毒DNA在乳汁中的分布情況，為建立可行、標(biāo)準的乳汁HBV DNA檢測方法提供依據(jù)。方法建立乳汁成分干擾模型、生理鹽水對照模型，比較干擾模型與對照模型中的HBV-DNA檢測結(jié)果。在HBV-DNA陰性乳汁中摻入高中低值標(biāo)準HBV DNA陽性血清，分別取樣本乳酪層、乳清與沉淀進行HBV-DNA檢測。結(jié)果乳酪、乳清、沉淀干擾模型分別與鹽水對照模型比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為3.30、3.00、4.60，P＜0.05)。乳酪、乳清、沉淀干擾模型間相互比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。在摻入高值和中值標(biāo)準血清時，HBV-DNA在乳酪、乳清和沉淀中的測定結(jié)果兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中沉淀中的測定結(jié)果最高，其次為乳清，最低的為乳酪層；在摻入低值標(biāo)準血清后，除乳酪與沉淀中的HBV-DNA測定結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)外，其余差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論乳汁主要成分對于乳汁樣本中HBV-DNA的檢測具有干擾作用，使得測定值低于實際值。乳汁樣本中HBV-DNA主要存在于沉淀部分，乳清、乳酪中也同時存在HBV-DNA。

乙型肝炎病毒；DNA；乳汁

我國是一個乙肝大國，乙型肝炎病毒（HBV）攜帶者高達1.4億。母嬰傳播是乙肝的重要傳播途徑。在我國孕婦中乙型肝炎病毒攜帶者為10%~20%，而母嬰傳播途徑最活躍的因素就是乳汁傳播。HBV-DNA定量檢測是乙型肝炎攜帶者是否具有傳染性的金標(biāo)準，因此不少學(xué)者致力于乳汁標(biāo)本中HBV-DNA的檢測，以確定母乳喂養(yǎng)是否安全可靠[1]。然而，乳汁組成復(fù)雜，富含脂肪、蛋白質(zhì)及乳糖[2]，且乳汁為渾濁非勻相液體，與血清不同，因而適用于血清標(biāo)本中HBV-DNA檢測的方法是否適用于乳汁標(biāo)本有待探討。目前國內(nèi)尚無標(biāo)準化的乳汁中HBV DNA檢測程序，各學(xué)者采用的研究方法和結(jié)果不盡相同。建立標(biāo)準化的乳汁中HBV DNA檢測方法勢在必行。本研究僅從乳汁成分對實時熒光定量檢測HBV DNA的影響及HBV DNA在乳汁中分布情況著手，以期為乳汁中HBV DNA檢測標(biāo)準方法的建立提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 陰性乳汁收集2012年6~12月我院婦產(chǎn)科分娩產(chǎn)婦乳汁30份，經(jīng)乙型肝炎血清標(biāo)志物及HBV-DNA檢測均為陰性，確定乳汁中不攜帶乙型肝炎病毒。

1.2 標(biāo)準陽性血清從2012年6~12月來我院就診進行血清HBV-DNA檢測標(biāo)本中，留取30份無溶血、無黃疸、無脂血陽性標(biāo)本，充分混勻后，平行進行HBV-DNA檢測10次，取均值3.97×107IU/ml作為該混合血清的HBV-DNA定量值。將該混合血清分裝于1.5 ml Eppendorf管備用。

1.3 方法

1.3.1 乳汁干擾實驗乳汁于冰箱中靜置24 h。乳汁分為三層：最上層為乳酪層（脂肪顆粒為主），中間為乳清（蛋白質(zhì)、糖類為主），底部為有形成分沉淀。根據(jù)乳汁性狀特點，建立乳酪干擾模型、乳清干擾模型、沉淀干擾模型如下：取HBV-DNA陰性乳汁8 ml取上中下三層各700μl于3只Eppendorf管中，每管加入標(biāo)準陽性血清各700μl制成乳汁成分干擾模型；同時取無菌生理鹽水700μl與700μl標(biāo)準陽性血清加入Eppendorf管中制成對照模型，將四種模型充分震蕩混勻備用。每種模型按照血清HBV-DNA實時熒光定量標(biāo)準檢測方法同時平行檢測HBV-DNA10次。

1.3.2 乳汁中HBV-DNA的分布情況取標(biāo)準陽性血清用無菌生理鹽水稀釋10、100、1 000倍，制成高、中、低三種濃度標(biāo)準血清模板，每種濃度取100μl于Eppendorf管中(平行做10份)，每管分別加入900μl HBV-DNA陰性乳汁，震蕩混勻，12 000轉(zhuǎn)離心10 min，分別取離心后的乳酪、乳清、沉淀部分各100μl加入新的Eppendorf管中，每管加入100μl DNA濃縮液。震蕩混勻后12 000轉(zhuǎn)離心10 min；去上清，沉淀加入DNA提取液20μl，100℃干浴10 min；冷卻后12 000轉(zhuǎn)離心10 min，取上清液2μl加入PCR反應(yīng)管進行擴增檢測。

1.4 主要試劑和儀器HBV-DNA定量檢測試劑盒（中山大學(xué)達安基因股份有限公司），達安7600 PCR擴增儀，杭州奧康K30B干式恒溫器，姜堰新康XK96-B快速混勻器，上海安亭TGL-168高速離心機。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法所得數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準差(x-±s)表示，統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS12.0軟件進行，計數(shù)資料用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳汁成分干擾實驗結(jié)果乳酪干擾模型、乳清干擾模型、沉淀擾模型與生理鹽水對照模型比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為3.30、3.00、4.60，P＜0.05)。乳酪干擾模型、乳清干擾模型、沉淀干擾模型間相互比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。以生理鹽水對照模型HBV-DNA檢測結(jié)果為標(biāo)準計算乳酪、乳清、沉淀三組干擾模型中HBV-DNA的回收率分別為43.8%、53.6%、41.0%(回收率=干擾模型HBV-DNA測定結(jié)果/對照模型HBV-DNA測定結(jié)果)×100%)，與國內(nèi)文獻報道不一致[3]。而三種干擾模型間相互比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。乳汁干擾實驗結(jié)果見表1。

表1 乳汁成分干擾實驗結(jié)果

2.2 不同載量的乳汁各層HBV DNA檢測結(jié)果比較在摻入高值和中值標(biāo)準血清時，HBV-DNA在乳酪層、乳清和沉淀中的測定結(jié)果兩兩比較P<0.05，其中沉淀中的測定結(jié)果最高，其次為乳清，最低的為乳酪層；在摻入低值標(biāo)準血清后，除乳酪層與沉淀中的HBV-DNA測定結(jié)果P<0.05外，其余P>0.05，見表2。

表2 不同載量的乳汁各層HBV DNA檢測結(jié)果比較

表2 不同載量的乳汁各層HBV DNA檢測結(jié)果比較

注：a為乳酪層與乳清比較，b為乳清與沉淀比較，c為乳酪層與沉淀比較。

組別樣本類型t值P值高值中值低值乳酪層乳清沉淀乳酪層乳清沉淀乳酪層乳清沉淀結(jié)果測定值（IU/ml）(1.87±0.26)×105(3.37±1.21)×105(7.65±0.82)×105(1.94±0.49)×104(2.58±0.36)×104(3.05±0.25)×104(2.27±0.55)×103(2.67±1.11)×103(2.76±0.46)×103對數(shù)值5.27±0.07 5.49±0.22 5.88±0.05 4.28±0.11 4.41±0.06 4.48±0.04 3.35±0.11 3.39±0.20 3.44±0.08 3.58a7.17b8.40c2.84a2.82b6.03c1.58a0.92b4.78c<0.05a<0.05b<0.05c<0.05a<0.05b<0.05c>0.05a>0.05b<0.05c

3 討論

國內(nèi)對于乳汁HBV-DNA檢測的研究大多集中于乳汁中攜帶乙肝病毒與母乳喂養(yǎng)安全方面，且對于乳汁中HBV DNA檢測的方法并不一致，對于檢測結(jié)果的準確性難以衡量。本次研究旨在探討乳汁成分對HBV-DNA檢測是否具有影響以及乙肝病毒顆粒在乳汁中分布的情況，以期為建立可行、標(biāo)準的乳汁標(biāo)本HBV-DNA檢測方法提供依據(jù)。

目前國內(nèi)外大多臨床實驗室采用實時熒光定量PCR檢測HBV-DNA，其試劑及操作程序僅相對于血清樣本。由于乳汁中含有大量脂肪顆粒、蛋白質(zhì)、上皮細胞及其他有形成分，使得我們對于乳汁樣本HBV DNA的檢測不能簡單的按照血清樣本的檢測方法進行。

我們首先考慮的是乳汁樣本成分的復(fù)雜性是否會影響樣本中HBV-DNA的檢測。為此，我們收集HBV-DNA陰性的乳汁標(biāo)本，經(jīng)自然沉淀后，分別在乳酪層、乳清、沉淀中摻入等量標(biāo)準陽性血清制成干擾模型，以無菌生理鹽水摻入等量標(biāo)準陽性血清制成對照模型。通過測定四種模型中的HBV-DNA，我們發(fā)現(xiàn)，三種干擾模型中HBV DNA的測定結(jié)果與對照模型相比，P<0.05，結(jié)果差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。同時計算三種模型中HBV-DNA的回收率，發(fā)現(xiàn)三種模型的回收率分別為43.8%、53.6%、41.0%，同樣反映出乳汁主要成分對于乳汁樣本中HBV-DNA的檢測具有干擾作用，使得測定結(jié)果低于實際值。但是，三種干擾模型的結(jié)果相互比較，發(fā)現(xiàn)彼此間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。由此認為，乳汁中對HBV DNA檢測的影響是共性的，經(jīng)自然沉淀后所形成的三層主要成分對于HBV DNA檢測具有相似的干擾作用。乳汁成分對HBV-DNA檢測的干擾作用可能作用于以下環(huán)節(jié)：(1)在HBV-DNA的濃縮沉淀過程中，由于乳汁中富含的脂肪和蛋白質(zhì)和有形物質(zhì)，使?jié)饪s液無法完全將樣本中所含的核酸完全沉淀，從而使部分核酸隨離心后的上清液被遺棄導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低。(2)由于乳汁中含有大量蛋白質(zhì)、糖類，使得乳汁的比例大于血清樣本，我們所使用的12 000轉(zhuǎn)離心所產(chǎn)生的離心力不足以使乳汁中存在的核酸完全沉淀，一部分隨離心后上清液被遺棄導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低。(3)在核酸抽提過程中，由于我們濃縮沉淀過程中收集到的沉淀數(shù)量較多，使加入的DNA提取液不能完全抽提沉淀中HBV DNA，離心后部分HBV-DNA仍然存在于沉淀中，無法進入上清液，導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低。(4)乳汁樣本中富含的脂類物質(zhì)、蛋白未被完全處理，隨著HBV-DNA模板一起進入到PCR反應(yīng)體系進行擴增，從而產(chǎn)生抑制作用，使得檢測結(jié)果偏低。(5)由于乳汁中乳糖含量豐富，而多糖是一類PCR抑制物[4]，使得乳汁樣本中HBV DNA的檢測結(jié)果偏低。有研究將乳汁中所含的脂肪顆粒作為影響乳汁樣本HBV-DNA檢測的主要因素[5]，而本次試驗中，脂肪顆粒含量最高的乳酪干擾模型與乳清、沉淀干擾模型中HBV-DNA的檢出結(jié)果差異并不存在統(tǒng)計學(xué)意義，說明脂肪顆粒是影響HBV-DNA檢測的因素之一，但不是決定性影響因素，乳汁樣本對于HBV-DNA檢測的影響是由脂肪顆粒、乳清成分（蛋白質(zhì)、糖類）以及乳汁中的有形成分共同造成的。

大多數(shù)學(xué)者認為乙肝病毒在乳汁中分布是不均勻的，但對于是主要分布在乳清還是沉淀部分存在爭議[6-7]。在本次研究中，我們對于摻入高中低三種標(biāo)準陽性血清進行分析，分別檢測其乳酪層、乳清及沉淀中的HBV-DNA含量，發(fā)現(xiàn)沉淀中HBV-DNA含量最高，其次為乳清，乳酪層最低，三者之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(在摻入低值血清的乳汁中，乳酪層與乳清，乳清與沉淀間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但乳酪層與沉淀間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義)。通過乳汁中HBV-DNA分布情況的研究，我們認為乳汁是一類特殊的樣本，即不同于血清均勻分布，又不同于其他體液完全集中于沉淀中，我們在臨床檢測中，以乳清或者沉淀替代乳汁整體來進行HBV-DNA檢測都是不可取的，并不能真實反映整個乳汁樣本中的HBV-DNA載量。

對于乳汁中HBV-DNA的檢測，即要充分考慮乳汁成分對于檢測的影響，又要考慮到HBV DNA在乳汁中的分布特點。而文獻報道中所采用的檢測方法往往只顧及其中一種因素甚至沒有考慮這些因素[8-9]，因此，有必要對乳汁樣本中HBV-DNA檢測的方法進行研究和改進，使得我們得到的結(jié)果能真實反映出待測樣本中HBV-DNA的載量。

[1]張春和,金艷,郭愛蘭,等.產(chǎn)婦乳汁HBV標(biāo)志物含量、HBV-DNA載量相關(guān)性與母乳喂養(yǎng)安全性的研究[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2009,24(5):108-110.

[2]韓立強,龐坤,劉愛清,等.鄭州市婦女乳汁中營養(yǎng)及活性成分的測定[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2010,45(1):59-61.

[3]周麗琴,尤建飛,呂時銘.586例乙肝病毒攜帶產(chǎn)婦乳汁HBV-DNA的檢測及分析[J].浙江醫(yī)學(xué),2005,27(11):816-821.

[4]李金明.實時熒光PCR技術(shù)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2011:71.

[5]余道軍,胡蘭蘭,吳盛海,等.乳汁樣本乙肝病毒DNA提取方法探討[J].國際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志,2010,37(2):91-94.

[6]王華忠,何學(xué)賢,譚可為,等.標(biāo)本前處理方法對乳汁HBV DNA檢測的影響[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2010,7(14):1419-1422.

[7]溫旺榮,蘇芳,吳勇,等.乳汁處理方法對檢測HBV DNA結(jié)果的影響[J].臨床檢驗雜志,2007,25(1):31.

[8]彭其才,許成芳,滕奔琦,等.產(chǎn)婦血清HBV DNA含量對乳汁和新生兒血清HBV DNA濃度的影響[J].中山大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2010,31(5):729-730.

[9]李國航,莊桂龍,瞿志軍,等.乙肝孕產(chǎn)婦血清HBV-DNA與乳汁HBV-DNA相關(guān)性的比較[J].臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志,2012,11(12): 953-954.

Influence of human breast milk on the quantitative detection of HBV-DNA.

WANG Dong-jian,ZHANG Xiao-yun, JIANGDing.DepartmentofClinicalLaboratory,theNo.184HospitalofthePLA,Yingtan335000,Jiangxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the influence of the compositions of human breast milk on the quantitative detection of HBV-DNA and the distribution of HBV-DNA in the human breast milk,and to provide the basis to set up a feasible and standard method for the quantitative detection of HBV-DNA in the human breast milk.MethodsWe set up the models interfere with cheese,whey,sediment and the compared model of physiological saline,and contrasted the HBV-DNA quantitative detection of interferential-model with compared-model. Then we mixed the high-value,mid-value and low-value standard HBV-DNA positive serum with HBV-DNA negative breast milk,and detected the HBV-DNA load in the cheese,whey and sediment.ResultsContrasted the HBV-DNA quantitative detection of the cheese interferential-model,whey interferential-model,sediment interferential-model with the physiological saline compared-model,the value of t were 3.30,3.00 and 4.60,and the value of P were less than 0.05.Contrasted the HBV-DNA quantitative detection between the cheese interferential-model,whey interferential-model and sediment interferential-model,the value of P were greater than 0.05.In the condition of mixed negative breast milk with high-value and mid-value standard serum,contrasted the HBV-DNA quantitative detection between the cheese,whey and sediment,the value of P were less than 0.05,and the quantity of HBV-DNA in the sediment was highest,in the whey was secondly and in the cheese was lowest.In the condition of mixed negative breast milk with low-value standard serum,the value of P were greater than 0.05 except the value of P contrasted between cheese and sediment was less than 0.05.ConclusionThe compositions of human breast milk can interfere the quantitative detect of HBV-DNA,which makes the estimated value less than the actual value.The HBV-DNA mostly exists in the sediment,also in the cheese and whey.

Hepatitis B virus;DNA;Human breast milk

R512.6+2

A

1003—6350（2013）16—2409—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.16.0993

2013-02-27）

張曉云。E-mail:w2013wdj184@163.com