連 方，劉 卓

>(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合生殖與遺傳中心，濟(jì)南 250011)

不孕癥是嚴(yán)重影響育齡夫婦雙方身心健康的世界性問(wèn)題，而試管嬰兒的問(wèn)世為人類(lèi)生殖自我調(diào)控樹(shù)立了新的里程碑。目前影響試管嬰兒成功率因素較多，如何改善和提高超排卵周期子宮內(nèi)膜容受性則是目前生殖醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。子宮內(nèi)膜只在一個(gè)很短的時(shí)間內(nèi)容納胚胎的植入(約排卵后6～10 d)，除了這個(gè)時(shí)間段，胚胎均不被接受，此期稱(chēng)為“種植窗(implantation window)”。經(jīng)過(guò)大量的研究證實(shí)子宮內(nèi)膜中降鈣素(calcitonin，CT)的表達(dá)與“種植窗”的開(kāi)放相吻合，是目前預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜接受能力的良好指標(biāo)，在胚胎著床過(guò)程中起重要作用［1-2］。本研究通過(guò)觀察不孕婦女在體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transtfer，IVFET)準(zhǔn)備周期中服用二至天癸顆粒后子宮內(nèi)膜CT mRNA表達(dá)的改變，探討補(bǔ)腎助孕中藥改善子宮內(nèi)膜容受性的分子機(jī)制，為中醫(yī)藥在 IVF-ET領(lǐng)域中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，進(jìn)而從分子基因水平，豐富和發(fā)展中醫(yī)“腎主生殖”理論。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 2010年05月至2011年10月就診于我中心行IVF-ET治療的92人，年齡25～35歲，原發(fā)或繼發(fā)不孕2～10年，均符合輸卵管阻塞［3］及腎陰虛型［4］診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除其它病因。隨機(jī)分為兩組，各46例。A組平均年齡為(31.42±3.19)歲，不孕年限為(4.43±2.59)年，用二至天癸顆粒預(yù)處理1個(gè)周期;B組平均年齡為(30.78±2.76)歲，不孕年限為(4.38±2.63)年，用六味地黃顆粒預(yù)處理1個(gè)周期。

1.2 方法

1.2.1 用藥方法及標(biāo)本采集 兩組均預(yù)處理一個(gè)周期，即A組(治療組)在行IVF前一周期于月經(jīng)的第3天始給予二至天癸顆粒，每日3次，每次1包，水沖服，共服用21 d，同時(shí)陰道B型超聲檢測(cè)卵泡發(fā)育見(jiàn)排卵后，于第7天取標(biāo)本，嚴(yán)格消毒后用小號(hào)刮匙搔刮子宮前壁少許內(nèi)膜組織，分別放入EP管中，立即液氮速凍，-70℃冰箱保存待測(cè)。并于當(dāng)日用電化學(xué)發(fā)光免疫法測(cè)定雌二醇(E2)、孕酮(P)，用超聲測(cè)量子宮內(nèi)膜厚度，3次取其平均值。同時(shí)在月經(jīng)的第21天采用GnRHa/r-FSH/HMG/HCG超排卵長(zhǎng)方案，即GnRHa(商品名為達(dá)菲林)1.2 mg肌肉注射，然后第二周期的月經(jīng)第3天始給予常規(guī)IVF長(zhǎng)方案治療，同時(shí)繼續(xù)服用二至天癸顆粒至注射絨毛膜促性腺激素(HCG)。根據(jù)B型超聲及血清激素水平變化，調(diào)整Gn用藥量。直到陰道超聲檢查顯示至少有2個(gè)直徑≥1.8 cm的卵泡或者3個(gè)直徑≥1.7 cm 的卵泡，子宮內(nèi)膜厚度 0.8～1.0 cm，呈均質(zhì)型或三線型，宮頸黏液拉絲度≥10 cm，再給予HCG 10000 IU一次性肌肉注射。B組(對(duì)照組)中藥改為六味地黃顆粒，余方案同前。

1.2.2 卵細(xì)胞的收集、體外培養(yǎng)和胚胎移植 注射HCG 36 h后在陰道B超引導(dǎo)下行穿刺取卵術(shù);將卵細(xì)胞按3～4個(gè)/孔，放入培養(yǎng)皿中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng);采用改良上游法或梯度法處理精液;取卵后4～6 h行精、卵體外受精(IVF);受精后18～22 h觀察受精情況;并換液，受精后根據(jù)胚胎發(fā)育的情況，適時(shí)選取優(yōu)質(zhì)胚胎行宮腔內(nèi)移植，同時(shí)于胚胎移植日測(cè)量E2和P水平。

1.2.3 移植后處理 移植后5 d(約取卵后6～10 d，即著床期)，用電化學(xué)發(fā)光免疫法測(cè)血清E2及P水平以了解胚胎的發(fā)育情況，并及時(shí)調(diào)整用藥;移植后5周做陰道B型超聲檢查，見(jiàn)胎囊、胎芽反射及胎心搏動(dòng)者診斷為臨床妊娠。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，β-actin在各組織中含量豐富穩(wěn)定，故將其作為內(nèi)參照。所有引物由北京西美杰科技有限公司合成。引物序列及擴(kuò)增片段見(jiàn)表1。

表1 CT和內(nèi)參β-actin引物序列及擴(kuò)增片段

1.2.5 RT-PCR 檢測(cè)

1.2.5.1 組織及細(xì)胞總RNA的提取 ① 取組織標(biāo)本約100 mg，移入組織勻漿器中，加入600 μl GIT變性液，勻漿后吸取500 μl至Eppendorf管中，以后操作同② ～⑤。② 每管加入 pH 4.02M NaAc 50 μl，顛倒混勻;再加入 500 μl水飽和酚，輕輕混勻;最后加入100 μl氯仿，顛倒充分混勻，冰浴10～15 min。③ 4℃ 12000 rpm離心10 min，吸取上清移至另一新1.5 ml Eppendorf管中，加入等體積的異丙醇，-20℃放置1 h。④4℃ 15000 rpm離心10 min，棄上清，加入100 μl GIT變性液，輕輕催打使沉淀溶解，加入等體積的異丙醇，-20℃放置1 h。⑤4℃ 15000 rpm離心10 min，棄上清，用無(wú)水乙醇洗一遍，棄上清，自然晾干，溶于適量的無(wú)Rnase的去離子水中，直接應(yīng)用，亦可加入1 ml無(wú)水乙醇于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.2 逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng) 于經(jīng)DEPC處理過(guò)的0.5 ml Eppendorf管中加入細(xì)胞總 RNA 11 μl，MMLV 1 μl，5 × RT buffer 4 μl，0.1mol DTT 2 μl，4 ×dNTP 1μl，隨機(jī)引物 1μl，去 RNase 水補(bǔ)至 20 μl?？焖匐x心混勻;37℃ 1 h，95℃ 10 min滅活M-MLV;快速離心使蒸汽沉于管底。

1.2.5.3 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 在上述5 μl RT產(chǎn)物的0.5 ml Eppendorf管中繼續(xù)加入10×PCR Buffer 5 μl，25mM MgCl24 μl，4 × dNTP 1μl，Taq DNA 聚合酶 1μl，上、下游引物各 0.5 μl，超純水 33 μl和液體石蠟30 μl。按95℃ 5 min?？焖匐x心混勻，進(jìn)一步循環(huán)條件:94℃ 1 min;58℃ 1 min;72℃ 1 min;共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延長(zhǎng)7 min。電泳鑒定。

1.2.5.4 定量分析 將凝膠電泳圖像輸入美國(guó)Kodak凝膠分析系統(tǒng)，應(yīng)用1D Image Analysis Software進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)度分析，按“相對(duì)系數(shù)=細(xì)胞因子表達(dá)強(qiáng)度/β-actin表達(dá)強(qiáng)度”公式計(jì)算相對(duì)系數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 β-actin mRNA和CT mRNA在子宮內(nèi)膜中的表達(dá) 由RT-PCR的電泳圖譜(圖1、2)可見(jiàn)，CT位于190 bp，內(nèi)參β-actin位于539 bp，與理論長(zhǎng)度一致。CT mRNA在各組子宮內(nèi)膜中均有表達(dá)，但表達(dá)量有一定的差異，A 組 0.84±0.08，B 組 0.76±0.07，兩組比較有顯著性差異(P ＜0.05);兩組在預(yù)處理周期著床期血清E2、P水平及子宮內(nèi)膜厚度比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05)(表2)。

表2 預(yù)處理著床期子宮內(nèi)膜CT mRNA表達(dá)、血清性激素水平及子宮內(nèi)膜厚度比較()

表2 預(yù)處理著床期子宮內(nèi)膜CT mRNA表達(dá)、血清性激素水平及子宮內(nèi)膜厚度比較()

注:與 B 組比較，*P ＜0.05

2.2 E2和P水平變化 由表3可知兩組預(yù)處理著床期血清E2、P水平與CT mRNA表達(dá)無(wú)相關(guān)性(P＞0.05)。由表4可知，胚胎移植日A組E2水平略高于B組，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異(P＞0.05);表5所示，兩組病人在兩個(gè)不同時(shí)期的著床期E2、P水平比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，可能與本研究樣本量較少有關(guān)，尚需進(jìn)一步探討。后經(jīng)臨床統(tǒng)計(jì)A組在治療中有25人妊娠，B組有15人妊娠，卡方值χ2=4.423，自由度 =2，P=0.035 ＜0.05，可見(jiàn)治療組妊娠率明顯優(yōu)于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 E2、P水平與CT mRNA表達(dá)的相關(guān)性

表4 胚胎移植日兩組病人E2、P水平的比較 ()

表4 胚胎移植日兩組病人E2、P水平的比較 ()

表5 兩個(gè)時(shí)期著床期的E2、P水平的比較()

表5 兩個(gè)時(shí)期著床期的E2、P水平的比較()

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，子宮內(nèi)膜容受性是保證孕卵著床、胎兒和胎盤(pán)發(fā)育的重要環(huán)節(jié)，有人提出一種理想的子宮容受性特異性標(biāo)志物，應(yīng)該存在于內(nèi)膜中，且最好接近著床部位，同時(shí)應(yīng)在“種植窗”期出現(xiàn)或早于一定的時(shí)間，并且在容受期終止時(shí)消失，降鈣素均符合這些條件，被認(rèn)為是目前預(yù)測(cè)“種植窗”期子宮內(nèi)膜容受性最有價(jià)值的生化標(biāo)志物［5］。CT是含有32個(gè)氨基酸殘基的肽類(lèi)激素，受體結(jié)合區(qū)集中在9-32位氨基酸序列，生物活性區(qū)集中在3-6位氨基酸序列，其兩端高度保守［6］。其主要由甲狀腺濾泡旁細(xì)胞合成和分泌，分布廣泛，遍布全身，研究發(fā)現(xiàn)子宮也能合成微量的CT，其mRNA的表達(dá)甚微，低于甲狀腺合成的1%，子宮通過(guò)自分泌和旁分泌的方式控制鈣離子的平衡來(lái)調(diào)節(jié)胚泡植入時(shí)的容受性狀態(tài)［7］。

目前隨著不孕患者的增多，臨床使用了大量的促排卵藥物及外源性的性腺激素和促性腺激素，可直接或間接影響體內(nèi)的激素平衡，干擾子宮內(nèi)膜容受性，從而影響胚胎著床，導(dǎo)致妊娠率下降。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎主生殖，為生胎之元，腎精充盛可促進(jìn)精卵的發(fā)育、子宮內(nèi)膜的增殖，由此可見(jiàn)，腎氣充盛，沖任通調(diào)是孕育的基本條件，故補(bǔ)腎和血是調(diào)經(jīng)種子的根本治療大法。二至天癸顆粒即以此理論為依據(jù)配伍而成，以二至丸、菟絲子、枸杞子補(bǔ)益腎氣，四物湯養(yǎng)血活血，佐以“女科之主帥”制香附行氣調(diào)經(jīng)?？v觀全方，補(bǔ)益腎陰、調(diào)達(dá)沖任，諸藥合用，則內(nèi)膜滋養(yǎng)有源，肝腎和調(diào)，沖盛任通，容受性自然提高，而胎成孕就。本文結(jié)果顯示該藥治療組的妊娠率為55.56%(25/45)，明顯高于六味地黃組的 33.33%(15/45)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.035 ＜0.05)。同時(shí)RT-PCR表明子宮內(nèi)膜的CT mRNA表達(dá)量存在組間差異，但治療期間檢測(cè)激素E2、P水平差異不大。對(duì)此分析可能是對(duì)照組六味地黃顆粒也能改善受孕條件，調(diào)節(jié)激素分泌，但對(duì)子宮著床的條件改善仍劣于二至天葵顆粒的緣故。

多年來(lái)臨床大量實(shí)驗(yàn)［8］也充分證明了中藥可發(fā)揮整體調(diào)節(jié)之優(yōu)勢(shì)，與外源性促性腺激素協(xié)同，調(diào)整機(jī)體潛在的自穩(wěn)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，這樣更加有力地彰顯了中醫(yī)“腎主生殖”理論在生殖功能調(diào)節(jié)方面所起到的巨大作用。本文通過(guò)分子水平檢測(cè)子宮內(nèi)膜CT mRNA表達(dá)量和激素水平對(duì)補(bǔ)腎中藥二至天癸顆粒在改善子宮內(nèi)膜容受性作用中的優(yōu)勢(shì)藥效加以闡釋?zhuān)瑸榕R床診療開(kāi)拓了新思路和新途徑。

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