孫世寶,盛玉文,于立春,曲更慶,王慶軍(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科,遼寧 錦州 121001)
膀胱癌有75%~85%是淺表性腫瘤[1],是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,膀胱癌術(shù)后灌注化療是減少?gòu)?fù)發(fā)率及延長(zhǎng)復(fù)發(fā)時(shí)間的必要措施。但長(zhǎng)期應(yīng)用絲裂霉素(MMC)灌注化療會(huì)產(chǎn)生一定的副作用和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。腫瘤細(xì)胞化療的同時(shí),耐藥性的產(chǎn)生有多重機(jī)制,可能涉及到Bcl-2基因的異常表達(dá)[2]。塞來(lái)昔布是一種選擇性環(huán)氧化酶2(Cyclooxygenase-2,COX-2)抑制劑非甾體消炎藥,具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[3]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)塞來(lái)昔布抑制腫瘤血管生成、增強(qiáng)治療藥物的敏感性與抑制基因Bcl-2的表達(dá)有關(guān),Bcl-2的表達(dá)可以增強(qiáng)腫瘤的化療療效和避免術(shù)后復(fù)發(fā)[4]。低劑量的MMC聯(lián)合使用塞來(lái)昔布不但可以提高療效,而且還可以減少不良反應(yīng)[5]。本研究探討MMC與塞來(lái)昔布聯(lián)合使用是否對(duì)淺表性膀胱癌T24細(xì)胞具有增殖抑制作用,并初步探討其機(jī)制。
細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國(guó)Beckman公司);CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo forma公司);倒置顯微鏡(日本Olympus公司);超速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司);CIAS-1000細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)(北京恒大圖像視覺(jué)有限公司);PowerPac3000電泳儀、EC-120電泳槽(美國(guó)Bio-Rad公司)。
MMC原料藥(批號(hào):H20020163,純度:99.9%)、塞來(lái)昔布原料藥(批號(hào):H20070325,純度:99.9%)均由海正輝瑞制藥有限公司提供;MTT注射用粉末(博大泰恒生物技術(shù)有限責(zé)任公司);兔抗人Bcl-2多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);TaKaRa RNA、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)試劑盒(寶生物工程大連有限公司);人細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(上海眾華生物有限公司);二甲基亞砜(DMSO,美國(guó)Amresco公司);RPMI 1640培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司)。
T24細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海分院提供。
用RPMI 1640培養(yǎng)液將MMC原料藥配制成1000μmol/L溶液,-20℃避光保存,應(yīng)用時(shí)稀釋至0、2、5、10、25、50μmol/L。
取塞來(lái)昔布原料藥,用DMSO溶解配制成100μmol/L溶液,應(yīng)用時(shí)稀釋至50μmol/L。
用0.01μmol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)將MTT配制成5μmol/L的MTT液。
T24細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基(加雙抗)中,將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于培養(yǎng)基中,隨機(jī)分組。
將T24細(xì)胞接種于96孔板中,3000個(gè)/孔,置于35℃、5%CO2恒溫孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)12 h,分為MMC[0(對(duì)照組)、2、5、10、25、50μmol/L]組及其與塞來(lái)昔布(50μmol/L)混合組,每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔。先加入50μmol/L塞來(lái)昔布溶液10μl培養(yǎng)8 h后,棄去培養(yǎng)液,再分別加入相應(yīng)濃度的MMC溶液20μl,繼續(xù)培養(yǎng)24 h;然后每孔均加MTT液20μl,培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng),離心棄去上清液;每孔加入DMSO 150μl,振蕩10 min使晶體充分溶解。用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度(OD)值,MMC組和混合組均為試驗(yàn)組。按公式計(jì)算各組細(xì)胞的增殖抑制率(IR),IR=(1-試驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。
取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照組、MMC組(50μmol/L)和混合[塞來(lái)昔布(50μmol/L)+MMC(50μmol/L)]組細(xì)胞給藥后48 h的爬片,同時(shí)用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照,染色,加入兔抗人Bcl-2多克隆抗體(1∶150稀釋,試驗(yàn)按其他比例稀釋時(shí)Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率較差),用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹(shù)膠封固,檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):凡細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯棕黃色顆粒者,為Bcl-2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞。每片觀察5個(gè)高倍視野,不少于500個(gè)細(xì)胞。
根據(jù)Genebank中已知基因序列,設(shè)計(jì)合成引物如下:VEGF上游引物序列為5′-ATGAACTTTCTGCTGTCTTGG-3′,下游引物序列為 5′-TCACCGCCTCGGCTTGTCACA-3′;β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)上游引物序列為5′-GATTGGAATCTGGCTACT-3′,下游引物序列為 5′-TAGGGCTGAAGCACAGGG-3′。提取“2.3”項(xiàng)下培養(yǎng)24h后的對(duì)照組、MMC(50μmol/L)組、混合[塞來(lái)昔布(50μmol/L)+MMC(50μmol/L)]組細(xì)胞的總RNA,取1μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,得到第1段cDNA,產(chǎn)物用于擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)條件:92℃5 min,92℃30 s,58℃1 min,72℃ 1min,反復(fù)循環(huán)30次,72℃延長(zhǎng)10min,結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳40 min,凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)目的條帶和β-actin的OD值,以其比值表示VEGF mRNA表達(dá),重復(fù)操作5次。
按ELISA試劑盒建立VEGF蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線,選取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照組、MMC組(50μmol/L)和混合[塞來(lái)昔布(50μmol/L)+MMC(50μmol/L)]組細(xì)胞,分別收集作用12、24、36、48、60、72、84、96 h后上層培養(yǎng)基[考慮此試驗(yàn)單獨(dú)使用MMC對(duì)T24細(xì)胞分泌VEGF蛋白的抑制作用不明顯(P>0.05),因此檢測(cè)另外兩組],每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)5個(gè)復(fù)孔,另外設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣本孔和空白對(duì)照孔,按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行加樣、洗板、顯色、檢測(cè)OD值(450 nm)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算最終濃度。
采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用表示,采用單因素方差分析法,兩兩比較用q檢驗(yàn),方差不齊用Dunett B檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
與對(duì)照組比較,MMC組細(xì)胞的IR明顯增加(P<0.05),且呈濃度依賴性。與MMC組相應(yīng)濃度比較,混合組細(xì)胞的IR均明顯增加(P<0.05),且呈濃度依賴性。表明塞來(lái)昔布能增強(qiáng)MMC對(duì)T24細(xì)胞的增殖抑制作用,結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 各組細(xì)胞的IR檢測(cè)結(jié)果(%%,,n=5)Tab 1 Inhibition rate of T24 bladder cancer cell proliferation in each grou(p%%,,n=5)
表1 各組細(xì)胞的IR檢測(cè)結(jié)果(%%,,n=5)Tab 1 Inhibition rate of T24 bladder cancer cell proliferation in each grou(p%%,,n=5)
與對(duì)照組比較:*P<0.05;與MMC組比較:#P<0.05vs.control group:*P<0.05;vs.MMC group:#P<0.05
組別M M C組混合組M M C,μmo l/L 5071.65±0.89*83.02±0.63#0 0254.10±0.49*#1.29±0.98*55.06±0.67#26.48±0.89*69.01±0.79#1035.61±0.81*77.07±0.60#2552.44±0.74*82.04±0.83#
結(jié)果表明,對(duì)照組、MMC組和混合組細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率分別為(90.23±6.17)%、(45.23±7.87)%、(35.69±6.30)%。與對(duì)照組比較,MMC組和混合組細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯降低(P<0.05)。與MMC組比較,混合組細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯降低(P<0.05)。表明塞來(lái)昔布能協(xié)同MMC降低Bcl-2蛋白的表達(dá)。顯微鏡圖見(jiàn)圖1。
結(jié)果表明,對(duì)照組、MMC組和混合組細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)分別為0.97±0.10、0.36±0.04、0.29±0.03。與對(duì)照組比較,MMC組和混合組細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。與MMC組比較,混合組細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。表明塞來(lái)昔布能增強(qiáng)MMC對(duì)T24細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)的抑制作用。電泳圖見(jiàn)圖2。
與對(duì)照組比較,混合組細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白質(zhì)量濃度隨作用時(shí)間延長(zhǎng)明顯降低,24 h后比較均有顯著性差異(P<0.01),且呈時(shí)間依賴性。混合組細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白的低表達(dá)可能與塞來(lái)昔布增強(qiáng)MMC對(duì)T24細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)的抑制作用有關(guān),結(jié)果見(jiàn)表2。
圖1 各組細(xì)胞免疫組化的顯微鏡圖(×400)A.對(duì)照組;B.MMC組;C.混合組Fig 1 Microscopic images of cell immunohistochemical expression in each grou(p×400)A.control group;B.MMC group;C.mixture group
圖2 各組細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)的電泳圖Fig 2 Electrophoretogram of mRNA expression of VEGF in each group
表2 作用不同時(shí)間兩組細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白濃度(,n=5)Tab 2 VEGF protein concentration of 2groups at different tim(e,n=5)
表2 作用不同時(shí)間兩組細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白濃度(,n=5)Tab 2 VEGF protein concentration of 2groups at different tim(e,n=5)
與對(duì)照組比較:*P<0.01vs.control group:*P<0.01
平均VEG F蛋白的質(zhì)量濃度,mg/L對(duì)照組3.906±0.0503.911±0.0963.865±0.0723.899±0.0653.853±0.0823.885±0.0763.789±0.0593.901±0.062時(shí)間,h 1224364860728496混合組3.714±0.0513.348±0.048*3.201±0.036*2.891±0.031*2.561±0.025*1.672±0.017*0.605±0.021*0.077±0.012*
有研究[6-7]表明,化療、放療過(guò)程中出現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞凋亡率下降可能和Bcl-2有關(guān)[7],其機(jī)制可能是COX-2上調(diào)Bcl-2的表達(dá)使Bcl-2高表達(dá)而抑制細(xì)胞的凋亡,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。關(guān)于這點(diǎn)本試驗(yàn)結(jié)果一致,即對(duì)照組Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯高于MMC組和混合組(P<0.05),MMC組和混合組細(xì)胞IR明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。
VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞的特異性有絲分裂源,也是一種有效的血管形成和通透性誘導(dǎo)因子。一方面VEGF可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移;另一方面,VEGF一直作用于腫瘤細(xì)胞,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分裂增殖。在人的膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌等研究中均見(jiàn)報(bào)道[8-9]。Bcl-2基因表達(dá)對(duì)VEGF產(chǎn)生有抑制作用,Bcl-2缺失的腫瘤細(xì)胞的VEGF出現(xiàn)高活性[10]。血管新生的調(diào)控除了和Bcl-2、VEGF等有關(guān)之外,還受其他多種因素的共同調(diào)節(jié)。研究[11]表明,VEGF的高表達(dá)可能與COX-2本身或其代謝產(chǎn)物前列腺素E2(PGE2)有關(guān)。本研究通過(guò)ELISA法檢測(cè)VEGF蛋白也可以得到證實(shí),混合組VEGF蛋白和藥物的作用時(shí)間具有相關(guān)性。目前還未見(jiàn)報(bào)道說(shuō)明VEGF與Bcl-2之間有直接相關(guān)性。
提高膀胱癌灌注化療和減少術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)及增強(qiáng)化療藥物的敏感性,是一個(gè)可以深入研究的問(wèn)題。本試驗(yàn)在體外環(huán)境下采用塞來(lái)昔布聯(lián)合MMC研究對(duì)T24細(xì)胞的增殖抑制作用。塞來(lái)昔布是一種常用的抗炎、鎮(zhèn)痛及退熱藥,此聯(lián)合使用對(duì)增強(qiáng)MMC對(duì)膀胱癌的化療療效和避免術(shù)后復(fù)發(fā)、改善患者生存質(zhì)量具有一定的意義,同時(shí)小劑量的使用MMC對(duì)降低化療費(fèi)用有一定的幫助。
[1]滕東海,張雁鋼,王曉鋒,等.吡柔比星與絲裂霉素C對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞株抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代泌尿外科雜志,2011,11(16):536.
[2]Ghassemifar R,F(xiàn)orster L,F(xiàn)inlayson J,et al.Differential expression of the Bcl-2and Bax isoforms in CD19positive B-lymphocytes isolated from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukaemia[J].Pathology,2012,44(7):632.
[3]Ke HL,Tu HP,Lin HH,et al.Cyclooxygenase-2(COX-2)up-regulation is a prognostic marker for poor clinical outcome of upper tract urothelial cancer[J].Anticancer Res,2012,32(9):4111.
[4]周斌,沈海波,曾彥愷,等.吡柔比星聯(lián)合塞來(lái)昔布對(duì)膀胱癌5637細(xì)胞株的作用[J].腫瘤,2010,6(30):467.
[5]張堅(jiān),徐卓群,胡強(qiáng),等.選擇性環(huán)氧合酶2抑制劑對(duì)人膀胱癌細(xì)胞T24增殖和凋亡的作用[J].癌癥,2007,26(4):377.
[6]Rahman M,ChanAPK,Tai IT.Apeptide of SPARC interferes with the interaction between caspase8 and Bcl2 to resensitize chemoresistant tumors and enhance their regression in vivo[J].PLoS One,2011,6(11):1.
[7]Ma L,Xie YL,Yu Y,et al.Apoptosis of human gastric cancer SGC-7901cells induced by mitomycin combined with sulindac[J].World J Gastroenterol,2005,11(12):1829.
[8]羅波,孫立江.膀胱移行細(xì)胞癌組織VEGF和COX-2表達(dá)及意義[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,45(1):29.
[9]仲劍,孫志華,吳強(qiáng),等.雷公藤甲素對(duì)人子宮內(nèi)膜癌抑制作用的裸鼠體內(nèi)研究[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2009,29(6):775.
[10]強(qiáng)占榮,覃泱,林中,等.選擇性COX-2抑制劑防治胃癌的研究現(xiàn)狀[J].西部醫(yī)學(xué),2010,22(5):939.
[11]梁平,靳風(fēng)爍,吳剛,等.COX-2和EGFR在膀胱移行細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其相關(guān)性研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,31(9):857.