孫世寶，盛玉文，于立春，曲更慶，王慶軍（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科，遼寧 錦州 121001）

膀胱癌有75%～85%是淺表性腫瘤[1]，是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，膀胱癌術(shù)后灌注化療是減少?gòu)?fù)發(fā)率及延長(zhǎng)復(fù)發(fā)時(shí)間的必要措施。但長(zhǎng)期應(yīng)用絲裂霉素（MMC）灌注化療會(huì)產(chǎn)生一定的副作用和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。腫瘤細(xì)胞化療的同時(shí)，耐藥性的產(chǎn)生有多重機(jī)制，可能涉及到Bcl-2基因的異常表達(dá)[2]。塞來(lái)昔布是一種選擇性環(huán)氧化酶2（Cyclooxygenase-2，COX-2）抑制劑非甾體消炎藥，具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[3]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)塞來(lái)昔布抑制腫瘤血管生成、增強(qiáng)治療藥物的敏感性與抑制基因Bcl-2的表達(dá)有關(guān)，Bcl-2的表達(dá)可以增強(qiáng)腫瘤的化療療效和避免術(shù)后復(fù)發(fā)[4]。低劑量的MMC聯(lián)合使用塞來(lái)昔布不但可以提高療效，而且還可以減少不良反應(yīng)[5]。本研究探討MMC與塞來(lái)昔布聯(lián)合使用是否對(duì)淺表性膀胱癌T24細(xì)胞具有增殖抑制作用，并初步探討其機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Beckman公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo forma公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；超速離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；CIAS-1000細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)（北京恒大圖像視覺(jué)有限公司）；PowerPac3000電泳儀、EC-120電泳槽（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

MMC原料藥（批號(hào):H20020163，純度:99.9%）、塞來(lái)昔布原料藥（批號(hào):H20070325，純度:99.9%）均由海正輝瑞制藥有限公司提供；MTT注射用粉末（博大泰恒生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；兔抗人Bcl-2多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；TaKaRa RNA、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）試劑盒（寶生物工程大連有限公司）；人細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（上海眾華生物有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國(guó)Amresco公司）；RPMI 1640培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司）。

1.3 細(xì)胞

T24細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海分院提供。

2 方法

2.1 溶液的制備

用RPMI 1640培養(yǎng)液將MMC原料藥配制成1000μmol/L溶液，－20℃避光保存，應(yīng)用時(shí)稀釋至0、2、5、10、25、50μmol/L。

取塞來(lái)昔布原料藥，用DMSO溶解配制成100μmol/L溶液，應(yīng)用時(shí)稀釋至50μmol/L。

用0.01μmol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液（PBS）將MTT配制成5μmol/L的MTT液。

2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)

T24細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基（加雙抗）中，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于培養(yǎng)基中，隨機(jī)分組。

2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制率

將T24細(xì)胞接種于96孔板中，3000個(gè)/孔，置于35℃、5%CO2恒溫孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)12 h，分為MMC[0（對(duì)照組）、2、5、10、25、50μmol/L]組及其與塞來(lái)昔布（50μmol/L）混合組，每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔。先加入50μmol/L塞來(lái)昔布溶液10μl培養(yǎng)8 h后，棄去培養(yǎng)液，再分別加入相應(yīng)濃度的MMC溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；然后每孔均加MTT液20μl，培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，離心棄去上清液；每孔加入DMSO 150μl，振蕩10 min使晶體充分溶解。用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度（OD）值，MMC組和混合組均為試驗(yàn)組。按公式計(jì)算各組細(xì)胞的增殖抑制率（IR），IR＝（1－試驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

2.4 免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)

取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照組、MMC組（50μmol/L）和混合[塞來(lái)昔布（50μmol/L）+MMC（50μmol/L）]組細(xì)胞給藥后48 h的爬片，同時(shí)用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，染色，加入兔抗人Bcl-2多克隆抗體（1∶150稀釋，試驗(yàn)按其他比例稀釋時(shí)Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率較差），用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封固，檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):凡細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯棕黃色顆粒者，為Bcl-2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞。每片觀察5個(gè)高倍視野，不少于500個(gè)細(xì)胞。

2.5 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)

根據(jù)Genebank中已知基因序列，設(shè)計(jì)合成引物如下:VEGF上游引物序列為5′-ATGAACTTTCTGCTGTCTTGG-3′，下游引物序列為 5′-TCACCGCCTCGGCTTGTCACA-3′；β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）上游引物序列為5′-GATTGGAATCTGGCTACT-3′，下游引物序列為 5′-TAGGGCTGAAGCACAGGG-3′。提取“2.3”項(xiàng)下培養(yǎng)24h后的對(duì)照組、MMC（50μmol/L）組、混合[塞來(lái)昔布（50μmol/L）+MMC（50μmol/L）]組細(xì)胞的總RNA，取1μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到第1段cDNA，產(chǎn)物用于擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)條件:92℃5 min，92℃30 s，58℃1 min，72℃ 1min，反復(fù)循環(huán)30次，72℃延長(zhǎng)10min，結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳40 min，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)目的條帶和β-actin的OD值，以其比值表示VEGF mRNA表達(dá)，重復(fù)操作5次。

2.6 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白濃度

按ELISA試劑盒建立VEGF蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，選取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照組、MMC組（50μmol/L）和混合[塞來(lái)昔布（50μmol/L）+MMC（50μmol/L）]組細(xì)胞，分別收集作用12、24、36、48、60、72、84、96 h后上層培養(yǎng)基[考慮此試驗(yàn)單獨(dú)使用MMC對(duì)T24細(xì)胞分泌VEGF蛋白的抑制作用不明顯（P＞0.05），因此檢測(cè)另外兩組]，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)5個(gè)復(fù)孔，另外設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣本孔和空白對(duì)照孔，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行加樣、洗板、顯色、檢測(cè)OD值（450 nm）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算最終濃度。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用表示，采用單因素方差分析法，兩兩比較用q檢驗(yàn)，方差不齊用Dunett B檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 T24細(xì)胞IR

與對(duì)照組比較，MMC組細(xì)胞的IR明顯增加（P＜0.05），且呈濃度依賴性。與MMC組相應(yīng)濃度比較，混合組細(xì)胞的IR均明顯增加（P＜0.05），且呈濃度依賴性。表明塞來(lái)昔布能增強(qiáng)MMC對(duì)T24細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞的IR檢測(cè)結(jié)果（%%，，n＝5）Tab 1 Inhibition rate of T24 bladder cancer cell proliferation in each grou（p%%，，n＝5）

表1 各組細(xì)胞的IR檢測(cè)結(jié)果（%%，，n＝5）Tab 1 Inhibition rate of T24 bladder cancer cell proliferation in each grou（p%%，，n＝5）

與對(duì)照組比較:＊P＜0.05；與MMC組比較:#P＜0.05vs.control group:＊P＜0.05；vs.MMC group:#P＜0.05

組別M M C組混合組M M C，μmo l/L 5071.65±0.89＊83.02±0.63#0 0254.10±0.49＊#1.29±0.98＊55.06±0.67#26.48±0.89＊69.01±0.79#1035.61±0.81＊77.07±0.60#2552.44±0.74＊82.04±0.83#

3.2 T24細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)

結(jié)果表明，對(duì)照組、MMC組和混合組細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率分別為（90.23±6.17）%、（45.23±7.87）%、（35.69±6.30）%。與對(duì)照組比較，MMC組和混合組細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯降低（P＜0.05）。與MMC組比較，混合組細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯降低（P＜0.05）。表明塞來(lái)昔布能協(xié)同MMC降低Bcl-2蛋白的表達(dá)。顯微鏡圖見(jiàn)圖1。

3.3 T24細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)

結(jié)果表明，對(duì)照組、MMC組和混合組細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)分別為0.97±0.10、0.36±0.04、0.29±0.03。與對(duì)照組比較，MMC組和混合組細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。與MMC組比較，混合組細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。表明塞來(lái)昔布能增強(qiáng)MMC對(duì)T24細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)的抑制作用。電泳圖見(jiàn)圖2。

3.4 T24細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白質(zhì)量濃度

與對(duì)照組比較，混合組細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白質(zhì)量濃度隨作用時(shí)間延長(zhǎng)明顯降低，24 h后比較均有顯著性差異（P＜0.01），且呈時(shí)間依賴性。混合組細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白的低表達(dá)可能與塞來(lái)昔布增強(qiáng)MMC對(duì)T24細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)的抑制作用有關(guān)，結(jié)果見(jiàn)表2。

4 討論

圖1 各組細(xì)胞免疫組化的顯微鏡圖（×400）A.對(duì)照組；B.MMC組；C.混合組Fig 1 Microscopic images of cell immunohistochemical expression in each grou（p×400）A.control group；B.MMC group；C.mixture group

圖2 各組細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)的電泳圖Fig 2 Electrophoretogram of mRNA expression of VEGF in each group

表2 作用不同時(shí)間兩組細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白濃度（，n＝5）Tab 2 VEGF protein concentration of 2groups at different tim（e，n＝5）

表2 作用不同時(shí)間兩組細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白濃度（，n＝5）Tab 2 VEGF protein concentration of 2groups at different tim（e，n＝5）

與對(duì)照組比較:＊P＜0.01vs.control group:＊P＜0.01

平均VEG F蛋白的質(zhì)量濃度，mg/L對(duì)照組3.906±0.0503.911±0.0963.865±0.0723.899±0.0653.853±0.0823.885±0.0763.789±0.0593.901±0.062時(shí)間，h 1224364860728496混合組3.714±0.0513.348±0.048＊3.201±0.036＊2.891±0.031＊2.561±0.025＊1.672±0.017＊0.605±0.021＊0.077±0.012＊

有研究[6-7]表明，化療、放療過(guò)程中出現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞凋亡率下降可能和Bcl-2有關(guān)[7]，其機(jī)制可能是COX-2上調(diào)Bcl-2的表達(dá)使Bcl-2高表達(dá)而抑制細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。關(guān)于這點(diǎn)本試驗(yàn)結(jié)果一致，即對(duì)照組Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯高于MMC組和混合組（P＜0.05），MMC組和混合組細(xì)胞IR明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。

VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞的特異性有絲分裂源，也是一種有效的血管形成和通透性誘導(dǎo)因子。一方面VEGF可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移；另一方面，VEGF一直作用于腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分裂增殖。在人的膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌等研究中均見(jiàn)報(bào)道[8-9]。Bcl-2基因表達(dá)對(duì)VEGF產(chǎn)生有抑制作用，Bcl-2缺失的腫瘤細(xì)胞的VEGF出現(xiàn)高活性[10]。血管新生的調(diào)控除了和Bcl-2、VEGF等有關(guān)之外，還受其他多種因素的共同調(diào)節(jié)。研究[11]表明，VEGF的高表達(dá)可能與COX-2本身或其代謝產(chǎn)物前列腺素E2（PGE2）有關(guān)。本研究通過(guò)ELISA法檢測(cè)VEGF蛋白也可以得到證實(shí)，混合組VEGF蛋白和藥物的作用時(shí)間具有相關(guān)性。目前還未見(jiàn)報(bào)道說(shuō)明VEGF與Bcl-2之間有直接相關(guān)性。

提高膀胱癌灌注化療和減少術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)及增強(qiáng)化療藥物的敏感性，是一個(gè)可以深入研究的問(wèn)題。本試驗(yàn)在體外環(huán)境下采用塞來(lái)昔布聯(lián)合MMC研究對(duì)T24細(xì)胞的增殖抑制作用。塞來(lái)昔布是一種常用的抗炎、鎮(zhèn)痛及退熱藥，此聯(lián)合使用對(duì)增強(qiáng)MMC對(duì)膀胱癌的化療療效和避免術(shù)后復(fù)發(fā)、改善患者生存質(zhì)量具有一定的意義，同時(shí)小劑量的使用MMC對(duì)降低化療費(fèi)用有一定的幫助。

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