孫世寶，盛玉文，于立春，曲更慶，王慶軍（遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院泌尿外科，遼寧 錦州 121001）

膀胱癌有75%～85%是淺表性腫瘤[1]，是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，膀胱癌術后灌注化療是減少復發(fā)率及延長復發(fā)時間的必要措施。但長期應用絲裂霉素（MMC）灌注化療會產生一定的副作用和復發(fā)風險。腫瘤細胞化療的同時，耐藥性的產生有多重機制，可能涉及到Bcl-2基因的異常表達[2]。塞來昔布是一種選擇性環(huán)氧化酶2（Cyclooxygenase-2，COX-2）抑制劑非甾體消炎藥，具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用[3]。近年來發(fā)現塞來昔布抑制腫瘤血管生成、增強治療藥物的敏感性與抑制基因Bcl-2的表達有關，Bcl-2的表達可以增強腫瘤的化療療效和避免術后復發(fā)[4]。低劑量的MMC聯(lián)合使用塞來昔布不但可以提高療效，而且還可以減少不良反應[5]。本研究探討MMC與塞來昔布聯(lián)合使用是否對淺表性膀胱癌T24細胞具有增殖抑制作用，并初步探討其機制。

1 材料

1.1 儀器

細胞計數儀（美國Beckman公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo forma公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；超速離心機（美國Sigma公司）；CIAS-1000細胞圖像分析系統(tǒng)（北京恒大圖像視覺有限公司）；PowerPac3000電泳儀、EC-120電泳槽（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

MMC原料藥（批號:H20020163，純度:99.9%）、塞來昔布原料藥（批號:H20070325，純度:99.9%）均由海正輝瑞制藥有限公司提供；MTT注射用粉末（博大泰恒生物技術有限責任公司）；兔抗人Bcl-2多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；TaKaRa RNA、實時定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）試劑盒（寶生物工程大連有限公司）；人細胞血管內皮生長因子（VEGF）、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海眾華生物有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國Amresco公司）；RPMI 1640培養(yǎng)液（美國Gibco公司）。

1.3 細胞

T24細胞由中國科學院上海分院提供。

2 方法

2.1 溶液的制備

用RPMI 1640培養(yǎng)液將MMC原料藥配制成1000μmol/L溶液，－20℃避光保存，應用時稀釋至0、2、5、10、25、50μmol/L。

取塞來昔布原料藥，用DMSO溶解配制成100μmol/L溶液，應用時稀釋至50μmol/L。

用0.01μmol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液（PBS）將MTT配制成5μmol/L的MTT液。

2.2 細胞的培養(yǎng)

T24細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基（加雙抗）中，將對數生長期的細胞接種于培養(yǎng)基中，隨機分組。

2.3 MTT法檢測細胞的增殖抑制率

將T24細胞接種于96孔板中，3000個/孔，置于35℃、5%CO2恒溫孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)12 h，分為MMC[0（對照組）、2、5、10、25、50μmol/L]組及其與塞來昔布（50μmol/L）混合組，每個濃度5個復孔。先加入50μmol/L塞來昔布溶液10μl培養(yǎng)8 h后，棄去培養(yǎng)液，再分別加入相應濃度的MMC溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；然后每孔均加MTT液20μl，培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，離心棄去上清液；每孔加入DMSO 150μl，振蕩10 min使晶體充分溶解。用酶標儀在490 nm波長處測定各孔光密度（OD）值，MMC組和混合組均為試驗組。按公式計算各組細胞的增殖抑制率（IR），IR＝（1－試驗組OD值/對照組OD值）×100%。

2.4 免疫組化法檢測細胞內Bcl-2蛋白表達

取“2.3”項下對照組、MMC組（50μmol/L）和混合[塞來昔布（50μmol/L）+MMC（50μmol/L）]組細胞給藥后48 h的爬片，同時用PBS代替一抗作為陰性對照，染色，加入兔抗人Bcl-2多克隆抗體（1∶150稀釋，試驗按其他比例稀釋時Bcl-2蛋白表達陽性率較差），用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復染，中性樹膠封固，檢測各組細胞內Bcl-2蛋白表達陽性率。結果判斷標準:凡細胞質中出現明顯棕黃色顆粒者，為Bcl-2蛋白陽性細胞。每片觀察5個高倍視野，不少于500個細胞。

2.5 RT-PCR檢測細胞內VEGF mRNA表達

根據Genebank中已知基因序列，設計合成引物如下:VEGF上游引物序列為5′-ATGAACTTTCTGCTGTCTTGG-3′，下游引物序列為 5′-TCACCGCCTCGGCTTGTCACA-3′；β-肌動蛋白（β-actin）上游引物序列為5′-GATTGGAATCTGGCTACT-3′，下游引物序列為 5′-TAGGGCTGAAGCACAGGG-3′。提取“2.3”項下培養(yǎng)24h后的對照組、MMC（50μmol/L）組、混合[塞來昔布（50μmol/L）+MMC（50μmol/L）]組細胞的總RNA，取1μg RNA進行逆轉錄，得到第1段cDNA，產物用于擴增目的基因。反應條件:92℃5 min，92℃30 s，58℃1 min，72℃ 1min，反復循環(huán)30次，72℃延長10min，結束反應。PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳40 min，凝膠成像系統(tǒng)檢測目的條帶和β-actin的OD值，以其比值表示VEGF mRNA表達，重復操作5次。

2.6 ELISA法檢測細胞內VEGF蛋白濃度

按ELISA試劑盒建立VEGF蛋白標準曲線，選取“2.3”項下對照組、MMC組（50μmol/L）和混合[塞來昔布（50μmol/L）+MMC（50μmol/L）]組細胞，分別收集作用12、24、36、48、60、72、84、96 h后上層培養(yǎng)基[考慮此試驗單獨使用MMC對T24細胞分泌VEGF蛋白的抑制作用不明顯（P＞0.05），因此檢測另外兩組]，每個時間點設5個復孔，另外設置標準孔、待測樣本孔和空白對照孔，按試劑盒說明進行加樣、洗板、顯色、檢測OD值（450 nm）。根據標準曲線計算最終濃度。

2.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料用表示，采用單因素方差分析法，兩兩比較用q檢驗，方差不齊用Dunett B檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 T24細胞IR

與對照組比較，MMC組細胞的IR明顯增加（P＜0.05），且呈濃度依賴性。與MMC組相應濃度比較，混合組細胞的IR均明顯增加（P＜0.05），且呈濃度依賴性。表明塞來昔布能增強MMC對T24細胞的增殖抑制作用，結果見表1。

表1 各組細胞的IR檢測結果（%%，，n＝5）Tab 1 Inhibition rate of T24 bladder cancer cell proliferation in each grou（p%%，，n＝5）

表1 各組細胞的IR檢測結果（%%，，n＝5）Tab 1 Inhibition rate of T24 bladder cancer cell proliferation in each grou（p%%，，n＝5）

與對照組比較:＊P＜0.05；與MMC組比較:#P＜0.05vs.control group:＊P＜0.05；vs.MMC group:#P＜0.05

組別M M C組混合組M M C，μmo l/L 5071.65±0.89＊83.02±0.63#0 0254.10±0.49＊#1.29±0.98＊55.06±0.67#26.48±0.89＊69.01±0.79#1035.61±0.81＊77.07±0.60#2552.44±0.74＊82.04±0.83#

3.2 T24細胞內Bcl-2蛋白表達

結果表明，對照組、MMC組和混合組細胞內Bcl-2蛋白表達陽性率分別為（90.23±6.17）%、（45.23±7.87）%、（35.69±6.30）%。與對照組比較，MMC組和混合組細胞內Bcl-2蛋白表達陽性率明顯降低（P＜0.05）。與MMC組比較，混合組細胞內Bcl-2蛋白表達陽性率明顯降低（P＜0.05）。表明塞來昔布能協(xié)同MMC降低Bcl-2蛋白的表達。顯微鏡圖見圖1。

3.3 T24細胞內VEGF mRNA表達

結果表明，對照組、MMC組和混合組細胞內VEGF mRNA表達分別為0.97±0.10、0.36±0.04、0.29±0.03。與對照組比較，MMC組和混合組細胞內VEGF mRNA表達明顯降低（P＜0.05）。與MMC組比較，混合組細胞內VEGF mRNA表達明顯降低（P＜0.05）。表明塞來昔布能增強MMC對T24細胞內VEGF mRNA表達的抑制作用。電泳圖見圖2。

3.4 T24細胞內VEGF蛋白質量濃度

與對照組比較，混合組細胞內VEGF蛋白質量濃度隨作用時間延長明顯降低，24 h后比較均有顯著性差異（P＜0.01），且呈時間依賴性?；旌辖M細胞內VEGF蛋白的低表達可能與塞來昔布增強MMC對T24細胞VEGF mRNA表達的抑制作用有關，結果見表2。

4 討論

圖1 各組細胞免疫組化的顯微鏡圖（×400）A.對照組；B.MMC組；C.混合組Fig 1 Microscopic images of cell immunohistochemical expression in each grou（p×400）A.control group；B.MMC group；C.mixture group

圖2 各組細胞內VEGF mRNA表達的電泳圖Fig 2 Electrophoretogram of mRNA expression of VEGF in each group

表2 作用不同時間兩組細胞內VEGF蛋白濃度（，n＝5）Tab 2 VEGF protein concentration of 2groups at different tim（e，n＝5）

表2 作用不同時間兩組細胞內VEGF蛋白濃度（，n＝5）Tab 2 VEGF protein concentration of 2groups at different tim（e，n＝5）

與對照組比較:＊P＜0.01vs.control group:＊P＜0.01

平均VEG F蛋白的質量濃度，mg/L對照組3.906±0.0503.911±0.0963.865±0.0723.899±0.0653.853±0.0823.885±0.0763.789±0.0593.901±0.062時間，h 1224364860728496混合組3.714±0.0513.348±0.048＊3.201±0.036＊2.891±0.031＊2.561±0.025＊1.672±0.017＊0.605±0.021＊0.077±0.012＊

有研究[6-7]表明，化療、放療過程中出現的腫瘤細胞凋亡率下降可能和Bcl-2有關[7]，其機制可能是COX-2上調Bcl-2的表達使Bcl-2高表達而抑制細胞的凋亡，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。關于這點本試驗結果一致，即對照組Bcl-2蛋白的表達明顯高于MMC組和混合組（P＜0.05），MMC組和混合組細胞IR明顯低于對照組（P＜0.05）。

VEGF是內皮細胞的特異性有絲分裂源，也是一種有效的血管形成和通透性誘導因子。一方面VEGF可以促進腫瘤細胞生長、轉移；另一方面，VEGF一直作用于腫瘤細胞，促進腫瘤細胞的分裂增殖。在人的膀胱癌、子宮內膜癌等研究中均見報道[8-9]。Bcl-2基因表達對VEGF產生有抑制作用，Bcl-2缺失的腫瘤細胞的VEGF出現高活性[10]。血管新生的調控除了和Bcl-2、VEGF等有關之外，還受其他多種因素的共同調節(jié)。研究[11]表明，VEGF的高表達可能與COX-2本身或其代謝產物前列腺素E2（PGE2）有關。本研究通過ELISA法檢測VEGF蛋白也可以得到證實，混合組VEGF蛋白和藥物的作用時間具有相關性。目前還未見報道說明VEGF與Bcl-2之間有直接相關性。

提高膀胱癌灌注化療和減少術后腫瘤的復發(fā)及增強化療藥物的敏感性，是一個可以深入研究的問題。本試驗在體外環(huán)境下采用塞來昔布聯(lián)合MMC研究對T24細胞的增殖抑制作用。塞來昔布是一種常用的抗炎、鎮(zhèn)痛及退熱藥，此聯(lián)合使用對增強MMC對膀胱癌的化療療效和避免術后復發(fā)、改善患者生存質量具有一定的意義，同時小劑量的使用MMC對降低化療費用有一定的幫助。

[1]滕東海，張雁鋼，王曉鋒，等.吡柔比星與絲裂霉素C對膀胱癌T24細胞株抑制作用的實驗研究[J].現代泌尿外科雜志，2011，11（16）:536.

[2]Ghassemifar R，Forster L，Finlayson J，et al.Differential expression of the Bcl-2and Bax isoforms in CD19positive B-lymphocytes isolated from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukaemia[J].Pathology，2012，44（7）:632.

[3]Ke HL，Tu HP，Lin HH，et al.Cyclooxygenase-2（COX-2）up-regulation is a prognostic marker for poor clinical outcome of upper tract urothelial cancer[J].Anticancer Res，2012，32（9）:4111.

[4]周斌，沈海波，曾彥愷，等.吡柔比星聯(lián)合塞來昔布對膀胱癌5637細胞株的作用[J].腫瘤，2010，6（30）:467.

[5]張堅，徐卓群，胡強，等.選擇性環(huán)氧合酶2抑制劑對人膀胱癌細胞T24增殖和凋亡的作用[J].癌癥，2007，26（4）:377.

[6]Rahman M，ChanAPK，Tai IT.Apeptide of SPARC interferes with the interaction between caspase8 and Bcl2 to resensitize chemoresistant tumors and enhance their regression in vivo[J].PLoS One，2011，6（11）:1.

[7]Ma L，Xie YL，Yu Y，et al.Apoptosis of human gastric cancer SGC-7901cells induced by mitomycin combined with sulindac[J].World J Gastroenterol，2005，11（12）:1829.

[8]羅波，孫立江.膀胱移行細胞癌組織VEGF和COX-2表達及意義[J].青島大學醫(yī)學院學報，2009，45（1）:29.

[9]仲劍，孫志華，吳強，等.雷公藤甲素對人子宮內膜癌抑制作用的裸鼠體內研究[J].南京醫(yī)科大學學報:自然科學版，2009，29（6）:775.

[10]強占榮，覃泱，林中，等.選擇性COX-2抑制劑防治胃癌的研究現狀[J].西部醫(yī)學，2010，22（5）:939.

[11]梁平，靳風爍，吳剛，等.COX-2和EGFR在膀胱移行細胞癌組織中的表達及其相關性研究[J].第三軍醫(yī)大學學報，2009，31（9）:857.