余春梅，楊秀麗，鄭小鋒，陳家香，鄒意瓊，陳 蘭（西南藥業(yè)股份有限公司藥物研究所，重慶 400038）

鹽酸伊立替康為喜樹等植物中含有的抗腫瘤生物堿——喜樹堿的水溶性衍生物，其可抑制Ⅰ型DNA拓樸構型異構酶而阻礙DNA的合成，從而顯示抗腫瘤活性。本品及其代謝產物SN-38對細胞周期S期具有特異性抑制作用[1-3]。其制劑制備和應用較多，本公司生產的鹽酸伊立替康注射液即是其中的一種。為控制該產品質量，筆者建立了測定鹽酸伊立替康注射液[4-6]的含量和有關物質的高效液相色譜（HPLC）法。結果表明，建立的方法簡便、快捷、準確，適用于鹽酸伊立替康制劑的質量控制。

1 材料

1200型HPLC儀、紫外檢測器、二極管陣列檢測器（美國Agilent公司）；AB204-E分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；H66 MC超聲儀（無錫超聲電子設備廠）。

鹽酸伊立替康注射液（自制，批號:110701、110702、110703，規(guī)格:2 ml∶40 mg）；鹽酸伊立替康對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號:100767-201102，純度:93.4%）；甲醇、乙腈均為色譜純，磷酸二氫鈉等均為分析純，水為注射用水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱:Hypersile Luna（2）C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相:水溶液（含0.02 mol/L磷酸二氫鈉和0.008 mol/L辛烷磺酸鈉）-乙腈-甲醇＝59∶17∶24（V/V/V），流速:1.5 ml/min；檢測波長:255 nm；柱溫:40℃；進樣量:15μl。在此色譜條件下，取有關物質供試品溶液進樣，鹽酸伊立替康與有關物質峰的分離度大于1.5，鹽酸伊立替康的拖尾因子小于1.5，詳見圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗圖譜1.鹽酸伊立替康Fig 1 HPLC chromatograms of system suitability1.irinotecan hydrochloride

2.2 測定方法

2.2.1 含量測定。取本品，加流動相溶解并稀釋制成每1 ml約含1.0mg的溶液，搖勻，作為供試品溶液。另取對照品適量，同法操作，作為對照品溶液。取供試品溶液和對照品溶液各15μl注入色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算，即得。

2.2.2 有關物質測定。精密量取“2.2.1”項下供試品溶液1 ml置于100 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，作為對照溶液。取對照溶液15μl注入色譜儀，調節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%；另取供試品溶液15μl，注入色譜儀，記錄色譜圖至主成分色譜峰保留時間的3倍。供試品溶液中如有雜質峰，單個雜質峰不得大于對照溶液主峰0.2倍（0.2%），各雜質峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積（1.0%）。

2.3 方法學驗證

2.3.1 最低檢測限。取對照品溶液，以流動相稀釋制成系列濃度，分別進樣，以信噪比為3時確定檢測限為1.2 ng。

2.3.2 線性試驗。取鹽酸伊立替康對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并制成98.5、197.0、295.5、492.5、985.0μg/ml的溶液，分別進樣，記錄峰面積。以峰面積（A）對質量濃度（c）進行回歸分析，得回歸方程為A＝－196.12+12.01 c（r＝0.99997）。結果表明鹽酸伊立替康檢測質量濃度線性范圍為98.5～985.0μg/ml。

2.3.3 精密度試驗。取“2.2.1”項下的對照品溶液，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，計算RSD為0.09%，表明本法精密度好。

2.3.4 回收率試驗。取樣品適量，加流動相溶解制成含鹽酸伊立替康高、中、低（1.2、1.0、0.8mg/ml）3種水平的溶液各3份，取15μl注入色譜儀，記錄峰面積；另取鹽酸伊立替康對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成每1 ml約含1.0 mg的溶液，同法操作；按外標法以峰面積計算。結果，鹽酸伊立替康高、中、低3種水平的加樣回收率分別為99.4%（99.4%、99.6%、99.3%，RSD＝0.12%）、99.8%（99.9%、99.8%、99.7%，RSD＝0.10%）、99.6%（99.7%、99.5%、99.5%，RSD＝0.15%），平均回收率為99.6%（RSD＝0.12%）。

2.3.5 溶液穩(wěn)定性試驗。取“2.2.1”項下的供試品溶液，在0、2、4、6、8 h時，分別取樣進樣分析，測定主成分含量和有關物質的量。結果，單個雜質和總雜質量基本無變化，主成分、單個雜質和總雜質含量的RSD分別為0.15%、1.72%、0。

2.3.6 耐用性試驗。①流動相比例變化的影響:將流動相的比例調整±5%，取同一份供試品溶液，記錄雜質峰的峰面積，以峰面積計算RSD。結果RSD＝0.78%（n＝8），表明調整流動相比例±5%時，方法耐用性良好。②柱溫的影響:將柱溫分別調為35、40、45℃，取同一份供試品溶液，照“2.2.2”項下方法操作，記錄雜質峰峰面積，以峰面積計算RSD。結果RSD＝0.29%（n＝6），表明柱溫在35～45℃變化時，耐用性良好。

2.3.7 專屬性試驗。供試品原液:精密稱取樣品，配制成含鹽酸伊立替康約為1.0 mg/ml的溶液，作為供試品原液。

精密稱取樣品5份，均加適量流動相溶解。1份加入1 mol/L鹽酸溶液5 ml，80℃反應2 h，加1 mol/L氫氧化鈉溶液5 ml中和，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為酸破壞溶液；1份加1 mol/L氫氧化鈉溶液1 ml，80℃反應2 h，加1 mol/L鹽酸溶液1 ml中和，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為堿破壞溶液；1份加30%過氧化氫溶液2 ml，80℃反應2 h，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為氧化破壞溶液；1份在100℃下加熱4 h，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為高溫破壞溶液；1份在（4500±500）lx照度下照射48 h，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為光照破壞溶液。另精密稱取按處方比例配制的空白輔料適量，配制成空白輔料溶液。分別取上述7種及對照品溶液各15μl進樣，記錄色譜圖。結果顯示，輔料不干擾主成分和有關物質測定，各雜質峰與主峰均能達到基線分離，表明本法專屬性良好。破壞性試驗色譜見圖2。

圖2 破壞性試驗色譜圖A.空白輔料溶液；B.供試品原液；C.酸破壞溶液；D.堿破壞溶液；E.氧化破壞溶液；F.高溫破壞溶液；G.光照破壞溶液；H.對照品溶液；1.鹽酸伊立替康Fig 2 HPLC chromatograms of destructive testA.blank excipient solution；B.sample stock solution；C.solution destroyed by acid；D.solution destroyed by alkali；E.solution destroyed by oxidation；F.solution destroyed by high temperature；G.solution destroyed by light；H.substance control solution；1.irinotecan hydrochloride

2.3.8 樣品測定。照“2.2”項下方法測定3批鹽酸伊立替康注射液的含量及有關物質，結果見表1。

表1 樣品測定結果Tab 1 Determination results of samples

3 討論

（1）本文主要是建立鹽酸伊立替康注射液的有關物質和主成分含量測定方法。由于原料藥質檢時已經對合成過程的中間體和副產物進行了控制，且在穩(wěn)定性研究中這些雜質沒有增加，因此建立有關物質方法時，只對單個雜質和總雜質的限度進行了嚴格的控制，而未控制已知雜質。

（2）取鹽酸伊立替康破壞性試驗各溶液，經二極管陣列檢測器檢測。結果，鹽酸伊立替康和破壞產生的雜質均在255 nm波長處有最大吸收，且溶劑和輔料在此波長處未見干擾，故確定本試驗檢測波長為255 nm。

（3）在前期流動相的篩選中，曾設計了多組不同組成（磷酸鹽-甲醇、磷酸鹽-乙腈、辛烷磺酸鈉-甲醇、辛烷磺酸鈉-乙腈、辛烷/磷酸鹽-甲醇、辛烷/磷酸鹽-乙腈、辛烷/磷酸鹽-甲醇-乙腈）流動相系統(tǒng)。結果認為，乙腈-甲醇-水溶液（含有適量磷酸二氫鈉和辛烷磺酸鈉）組成的流動相系統(tǒng)優(yōu)于單一的甲醇和乙腈與緩沖鹽組成的系統(tǒng)。通過調整其不同的體積比，如辛烷/磷酸鹽-乙腈-甲醇（50∶25∶25）、（55∶20∶25）、（59∶16∶25）、（59∶17∶24）等，最終確立了本試驗采用的流動相。在該流動相下，主峰出峰時間合適，雜質峰與主峰能夠完全分離，適合本品主成分含量和有關物質的測定。

（4）本方法流動相中有離子對試劑，雖然可能對分析柱損害較大，但可以更好地保持主峰的峰形，使其拖尾因子符合要求，測定結果更準確。

（5）破壞性試驗中，由于本品在常溫下反應時基本無新的降解產物產生，故均在80℃下進行破壞試驗。

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