任　敏，武加標(biāo)，湯　麗，顧巧英，肖　菁，蔣立新，戚傳平，趙東寶

(江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，常州 213002)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性破壞性關(guān)節(jié)病變?yōu)樘卣鞯娜硇宰陨砻庖卟?，主要表現(xiàn)為雙手及腕的對(duì)稱(chēng)性關(guān)節(jié)炎。雖然大多研究認(rèn)為，RA是在抗原驅(qū)動(dòng)下與遺傳相關(guān)、多因素參與的疾病，但迄今病因仍不明。早期人們一直致力于對(duì)T細(xì)胞和B細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子和自身抗體介導(dǎo)的獲得性免疫進(jìn)行研究，探討其在RA滑膜損害及發(fā)病中的作用。然而，近年來(lái)Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)的發(fā)現(xiàn)使人們重新審視了天然免疫在RA發(fā)生機(jī)理中的作用。有報(bào)道TLR在RA的發(fā)病機(jī)理及膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型(collagen-induced arthritis，CIA)中起至關(guān)重要的作用[1-2]。Toll樣受體4(toll-like receptor-4，TLR4)作為第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的TLR，可通過(guò)識(shí)別病原體相關(guān)模式分子激活天然免疫系統(tǒng)，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，產(chǎn)生炎性因子白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1、IL-18等。TLR除了參與急性微生物感染導(dǎo)致的炎性反應(yīng)外，在RA慢性炎性反應(yīng)中也可能發(fā)揮了重要作用[3-5]。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RA患者CD14+單核細(xì)胞表面TLR4的陽(yáng)性率及平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)，并與對(duì)照組進(jìn)行比較。同時(shí)，分析RA患者TLR4陽(yáng)性率與其臨床和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性。

對(duì)象和方法

研究對(duì)象

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)組：同時(shí)期住院的7例OA患者納入疾病對(duì)照組，患者均為女性，年齡42～63歲，診斷均符合1990年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)制定的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)。

對(duì)照組：選取同時(shí)期江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院體檢中心健康志愿者39名。其中，男3名，女36名，年齡33～59歲。

RA組、OA組及對(duì)照組的年齡構(gòu)成均具可比性。

方法

試劑和儀器：流式檢測(cè)用熒光標(biāo)記單克隆抗體，抗人CD14-FITC(克隆號(hào)為61D3，購(gòu)自eBioscience公司)、抗人TLR4-PE(克隆號(hào)為HTA125，購(gòu)自eBioscience公司)、溶血?jiǎng)?購(gòu)自蘇州躍亞生物技術(shù)有限公司)，IL-18酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(購(gòu)自R&D公司)。酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-Rad680)，流式細(xì)胞儀(德國(guó)PARTEC公司)。

實(shí)驗(yàn)步驟：抽取3組受試者靜脈血2 ml于抗凝管中；每份標(biāo)本分裝4管，從第2管開(kāi)始，依次加入6 μl 抗CD14、5 μl抗TLR4和4 μl抗CD14、5μl抗TLR4，然后加入30 μl抗凝全血混勻，置室溫孵育20 min，后加50 μl溶血?jiǎng)浞只靹蚝笫覝亻]光15 min 使紅細(xì)胞充分溶解，置于離心機(jī)以1500 rm離心5 min，棄上清，用1 ml蒸餾水清洗2次，棄上清、重懸細(xì)胞加入1 ml蒸餾水，放入流式細(xì)胞儀進(jìn)行有關(guān)指標(biāo)測(cè)定。每管在圈定的總細(xì)胞中設(shè)置收集6 000個(gè)細(xì)胞，選取FSC-SSC散點(diǎn)圖上的單核細(xì)胞群，以CD14及TLR染色雙陽(yáng)性細(xì)胞百分率記錄結(jié)果。即TLR4(CD14+TLR4+)雙陽(yáng)性區(qū)域在試驗(yàn)患者組和正常對(duì)照組單核細(xì)胞表面陽(yáng)性率，并比較MFI。同時(shí)留取血清用ELISA檢測(cè)IL-18的表達(dá)水平。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)　　果

TLR4在RA外周血CD14+單核細(xì)胞表面陽(yáng)性率和MFI

TLR4在RA高度活動(dòng)組、中低度活動(dòng)組外周血CD14+單核細(xì)胞表面陽(yáng)性率分別于對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖1)。MFI在RA高度活動(dòng)組、中低度活動(dòng)組和對(duì)照組組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.15，P<0.05)(表1)。

不同病情RA患者外周血IL-18水平與對(duì)照組的差異

血清IL-18水平在RA高度活動(dòng)組最高，中低度活動(dòng)組次之，且均高于對(duì)照組。RA中低度活動(dòng)組及對(duì)照組血清IL-18水平分別與RA高度活動(dòng)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表2)。

TLR4外周血CD14+單核細(xì)胞表面陽(yáng)性率與血清IL-18水平、臨床指標(biāo)的相關(guān)性

RA高度活動(dòng)組TLR4外周血CD14+單核細(xì)胞表面陽(yáng)性率與血清IL-18水平呈正相關(guān)(r=0.261，P=0.032)，與DAS28呈負(fù)相關(guān)(r=-0.722，P=0.027)。

表1TLR4外周血CD14+單核細(xì)胞表面陽(yáng)性率和平均熒光強(qiáng)度

組別例數(shù)(n)TLR4陽(yáng)性率(%)TLR4平均熒光強(qiáng)度(道)RA高度活動(dòng)組1324 58±10 13?47 34±19 85RA中低度活動(dòng)組2132 47±12 40?42 56±17 41OA組710 23±3 4067 90±31 40對(duì)照組3913 14±5 2259 38±28 05F值—28 273 15P值—<0 010 029MS組內(nèi)—71 20613 21

TLR4：Toll樣受體4；RA：類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；OA：骨性關(guān)節(jié)炎；與對(duì)照組比較，*P<0.01

表2血清IL-18在3組中的表達(dá)水平

組別例數(shù)(n)IL?18(pg∕ml)RA高度活動(dòng)組13236 71±39 42RA中低度活動(dòng)組21195 32±20 69?對(duì)照組39185 49±42 96?F值—9 24P值—0 00027MS組內(nèi)—1390 57

IL-18：人白細(xì)胞介素18；RA：類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；與RA高度活動(dòng)組比較，*P<0.01

RA中低度活動(dòng)組TLR4外周血CD14+單核細(xì)胞表面陽(yáng)性率與血清IL-18水平無(wú)明顯相關(guān)性(r=-0.030，P=0.880)，與DAS28呈負(fù)相關(guān)(r=-0.398，P=0.036)。

對(duì)照組TLR4外周血CD14+單核細(xì)胞表面陽(yáng)性率與血清IL-18水平(r=0.320，P=0.800)及與DAS28(r=0.203，P=0.301)均無(wú)明顯相關(guān)性。

討　　論

RA發(fā)病的天然免疫機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，目前普遍認(rèn)為，微生物可能通過(guò)感染宿主使其產(chǎn)生免疫應(yīng)答促使RA發(fā)病，并非感染因素直接引起RA。炎性反應(yīng)持續(xù)的其中一個(gè)途徑是通過(guò)TLR發(fā)揮作用。TLR是連接天然與獲得性免疫的危險(xiǎn)信號(hào)受體，可促炎性因子受體表達(dá)于免疫細(xì)胞及非免疫細(xì)胞表面。在機(jī)體受到外界刺激，如感染、自身免疫紊亂等影響后，TLR通過(guò)分子模擬、表位擴(kuò)散及模糊識(shí)別機(jī)制導(dǎo)致免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)失衡，產(chǎn)生炎性反應(yīng)，參與由炎性因子介導(dǎo)的RA發(fā)生過(guò)程[6]。

TLR是進(jìn)化高度保守的一型跨膜蛋白，目前在人類(lèi)已有13種TLR(TLR1～TLR13)被鑒定出[7]。TLR4是研究最廣的受體，主要識(shí)別細(xì)菌脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)，在CD14的協(xié)助下啟動(dòng)下游信號(hào)控制炎性反應(yīng)，已發(fā)現(xiàn)Toll樣受體2(toll-like receptor-2，TLR2)和TLR4在RA患者的滑膜纖維母細(xì)胞及淋巴細(xì)胞表面高度表達(dá)[8]。Radstake等[9]通過(guò)免疫組化證明TLR4表達(dá)在RA患者的滑膜上，此后得到Ospelt等[10]的驗(yàn)證，且在RA早期階段高表達(dá)。然而在TLR4在RA患者外周血循環(huán)中表達(dá)情況及作用機(jī)制至今很少報(bào)道。

本研究表明，TLR4在RA患者外周血CD14+單核細(xì)胞表達(dá)高于對(duì)照組(上調(diào))，這一結(jié)果同國(guó)內(nèi)外學(xué)者報(bào)道的一致[11-13]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，病情高度活動(dòng)組、中低度活動(dòng)組陽(yáng)性率均高于對(duì)照組，由此提示：(1)活動(dòng)期RA患者體內(nèi)炎性因子的產(chǎn)生可能是TLR4介導(dǎo)的。然而值得討論的是，TLR4在靜息情況下表達(dá)在細(xì)胞表面，當(dāng)識(shí)別病原體細(xì)胞壁成分后被激活，但納入試驗(yàn)的患者已經(jīng)排除了合并細(xì)菌、病毒感染者，推測(cè)體內(nèi)存在類(lèi)似RA滑膜的內(nèi)源性配體，受體內(nèi)的配體驅(qū)動(dòng)激活細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，反復(fù)刺激使TLR4上調(diào)。(2)Iwahashi等[14]曾用CD16+陽(yáng)性群代表大部分單核細(xì)胞，結(jié)果表明CD16+細(xì)胞在患者外周血單核細(xì)胞中明顯增加。LPS-CD14-TLR4-NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)是TLR4的經(jīng)典途徑，TLR4陽(yáng)性率的增加也提示單核細(xì)胞起重要的橋梁作用。值得一提的是，RA高度活動(dòng)組的TLR4表達(dá)低于中低活動(dòng)組，這可能由于細(xì)胞表面的TLR4脫落到血清中，進(jìn)一步明確原因需進(jìn)行TLR4的血清含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

免疫細(xì)胞內(nèi)存在多層次不同靶點(diǎn)的負(fù)向調(diào)控分子，可以對(duì)TLR4所介導(dǎo)的信號(hào)通路的開(kāi)啟和傳導(dǎo)起到精確的負(fù)調(diào)控作用，從而抑制TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[15]。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)立OA組作為疾病對(duì)照組，其陽(yáng)性率低于RA各組，TLR4在RA高度活動(dòng)組、中低度活動(dòng)組和對(duì)照組3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其陽(yáng)性率差距不大，提示TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中存在精細(xì)的調(diào)控機(jī)制，以避免過(guò)強(qiáng)的免疫反應(yīng)，維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)平衡。

納入本研究的RA患者病程較長(zhǎng)(大多在6個(gè)月以上)，屬于非早期且為多為復(fù)診患者，入院時(shí)DAS28評(píng)分多為中低度活動(dòng)。當(dāng)炎性反應(yīng)轉(zhuǎn)為慢性、持續(xù)性時(shí)，TLR4的表達(dá)上調(diào)會(huì)給患者帶來(lái)不利影響，產(chǎn)生更多的炎性因子，后者除了聚集在關(guān)節(jié)滑膜上外，還會(huì)激活體內(nèi)的配體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。推測(cè)TLR4在活動(dòng)期的上調(diào)會(huì)反復(fù)刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致RA炎性反應(yīng)慢性持續(xù)發(fā)展。下一步研究則需要繼續(xù)監(jiān)測(cè)改善病情抗風(fēng)濕藥(disease-modifying antirheumatic drugs，DMARDs)治療前后TLR4的變化情況。

本研究結(jié)果提示，RA兩組的血清IL-18水平均高于正常組，提示RA病情活動(dòng)時(shí)有IL-18的參與。血清中IL-18作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游致炎因子，在RA發(fā)病機(jī)制中起重要作用，且在單核巨噬細(xì)胞中高表達(dá)。TLR4能有效識(shí)別“非己”成分而被活化，繼而激活NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子引起與免疫有關(guān)的細(xì)胞因子IL-18的分泌。本試驗(yàn)表明，RA高度活動(dòng)組TLR4陽(yáng)性率與DAS28呈負(fù)相關(guān)，而與IL-18的水平呈正相關(guān)。DAS28是反應(yīng)疾病活動(dòng)度的指標(biāo)之一，提示患者在RA活動(dòng)時(shí)TLR4的陽(yáng)性率反而降低，可能的原因是IL-18的水平增高不僅會(huì)招募單核細(xì)胞到滑膜組織，還會(huì)促使單核細(xì)胞聚集在外周血中，從而趨化內(nèi)源性配體，促使TLR4通路下傳，消耗性地表達(dá)降低。另外，其他炎性因子受到單核細(xì)胞招募聚集后也會(huì)加重RA的癥狀。研究者在試驗(yàn)中觀察到，TLR4在CD14+單核細(xì)胞上表達(dá)時(shí)，很明顯的變化是有些DAS28評(píng)估高度活動(dòng)的患者外周單核細(xì)胞群和細(xì)胞數(shù)目反而很少，其陽(yáng)性率會(huì)隨之降低，表明炎性活動(dòng)會(huì)使TLR4信號(hào)通路會(huì)被反復(fù)激發(fā)，級(jí)聯(lián)反應(yīng)后的IL-18增高反饋性調(diào)節(jié)TLR4降低，外周血單核細(xì)胞很容易被TLR4觸發(fā)產(chǎn)生致炎因子[16]。TLR4的表達(dá)上調(diào)影響IL-18的產(chǎn)生，而IL-18在RA患者的血清中濃度的增高是否會(huì)影響TLR4的表達(dá)值得進(jìn)一步探討。

在RA的發(fā)病機(jī)制中可能存在多種細(xì)胞類(lèi)型和可溶性因子之間的復(fù)雜的相互作用[17]，TLR4對(duì)RA炎性的觸發(fā)有間接潛在的驅(qū)動(dòng)作用，雖然不是在疾病的開(kāi)始，但可能是通過(guò)信號(hào)下游通路IL-18的產(chǎn)生促成RA反復(fù)發(fā)作。曾有學(xué)者設(shè)想TLR4是否可以作為治療RA的靶目標(biāo)，在臨床應(yīng)用大量腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor alpha，TNF)-a抑制劑的同時(shí)抑制TLR4，使癥狀得以控制[18]。已經(jīng)有報(bào)道TLR4抑制劑可抑制RA實(shí)驗(yàn)鼠的臨床癥狀和細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎性反應(yīng)[19]。

總之，本研究表明TLR4在RA患者外周血CD14+單核細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，TLR4的陽(yáng)性率與IL-18的水平呈正相關(guān)，與DAS28呈負(fù)相關(guān)，在一定程度上提示TLR4釋放炎性因子可能是RA反復(fù)發(fā)作的原因之一。因此，對(duì)于TLR4在分子水平的研究可能為RA的發(fā)病機(jī)制和防治提供依據(jù)。

(致謝：安徽省感染與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室蚌埠醫(yī)學(xué)院李柏青教授在流式方面的指導(dǎo)及對(duì)本文的修改意見(jiàn))

(本文圖1見(jiàn)插頁(yè)第Ⅱ頁(yè))

[1]Maciejewska Rodrigues H, Jungel A, Gay RE, et al. Innate immunity, epigenetics and autoimmunity in rheumatoid arthritis[J]. Mol Immunol, 2009, 47:12-18.

[2]Huang QQ, Pope RM. The role of toll-like receptors in rheumatoid arthritis[J]. Curr Rheumatol Rep, 2009,11:357-364.

[3]Dinarello CA. Immunological and inflammatory functions of the interleukin-1 family[J]. Annu Rev Immunol, 2009, 27:519-550.

[4]Gierut A, Perlman H, Pope RM. Innate immunity and rheumatoid arthritis[J]. Rheum Dis Clin North Am, 2010, 36:271-296.

[5]Falgarone G, Jaen O, Boissier MC. Role for innate immunity in rheumatoid arthritis[J]. Joint Bone Spine, 2005, 72:17-25.

[6]Barton GM, Kagan JC. A cell biological view of Toll-like receptor function: regulation through compartmentalization[J]. Nat Rev Immunol, 2009, 9:535-542.

[7]Moresco EM,LaVine D,Beutler B.Toll-like receptors[J].Curr Biol,2011,21:R488-493.

[8]Brentano F,Kyburz D,Gay S.Toll-like receptors and rheumatoid arthritis[J].Methods Mol Biol,2009,517:329-343.

[9]Radstake TR, Roelofs MF, Jenniskens YM, et al. Expression of toll-like receptors 2 and 4 in rheumatoid synovial tissue and regulation by proinflammatory cytokines interleukin-12 and interleukin-18 via interferon-gamma[J]. Arthritis Rheum, 2004, 50:3856-3865.

[10] Ospelt C, Brentano F, Rengel Y, et al. Overexpression of toll-like receptors 3 and 4 in synovial tissue from patients with early rheumatoid arthritis: toll-like receptor expression in early and longstanding arthritis[J]. Arthritis Rheum, 2008, 58:3684-3692.

[11] Huang Q, Ma Y, Adebayo A, et al. Increased macrophage activation mediated through toll-like receptors in rheumatoid arthritis[J]. Arthritis Rheum, 2007, 56:2192-2201.

[12] 潘正論, 張?jiān)闯? 許冬梅, 等. 天然免疫分子TLR2 TLR4在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的表達(dá)模式研究[J]. 中華風(fēng)濕病學(xué)雜志, 2005, 9:86-88.

[13] Kowalski ML, Wolska A, Grzegorczyk J, et al. Increased responsiveness to toll-like receptor 4 stimulation in peripheral blood mononuclear cells from patients with recent onset rheumatoid arthritis[J]. Mediators Inflamm, 2008, 2008:132732.

[14] Iwahashi M, Yamamura M, Aita T, et al. Expression of Toll-like receptor 2 on CD16+blood monocytes and synovial tissue macrophages in rheumatoid arthritis[J]. Arthritis Rheum, 2004, 50:1457-1467.

[15] Zeytun A,Chaudhary A,Pardington P, et al. Induction of cytokines and chemokines by Toll-like receptor signaling: strategies for control of inflammation[J]. Crit Rev Immunol, 2010, 30:53-67.

[16] Shahrara S, Park CC, Temkin V, et al. RANTES modulates TLR4-induced cytokine secretion in human peripheral blood monocytes[J]. J Immunol, 2006, 177:5077-5087.

[17] Ospelt C, Kyburz D, Pierer M, et al. Toll-like receptors in rheumatoid arthritis joint destruction mediated by two distinct pathways[J]. Ann Rheum Dis, 2004, 63:90-91.

[18] Sacre SM, Drexler SK, Andreakos E, et al. Could toll-like receptors provide a missing link in chronic inflammation in rheumatoid arthritis? Lessons from a study on human rheumatoid tissue[J]. Ann Rheum Dis, 2007, 66:81-86.

[19] Abdollahi-Roodsaz S, Joosten LA, Roelofs MF, et al.Inhibition of Toll-like receptor 4 breaks the inflammatory loop in autoimmune destructive arthritis[J]. Arthritis Rheum, 2007, 56:2957-2967.