史　群，林　瑋，胡朝軍，白伊娜，張　文，張奉春

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院 風濕免疫科，北京 100032)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、炎性多關節(jié)病并導致進展性的關節(jié)損傷和致殘。改善病情抗風濕藥(disease modified antirheumatic drugs，DMARDs)的應用可阻止RA患者關節(jié)炎性反應和骨侵蝕，改善預后。以腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)抑制劑為代表的生物制劑，如依納西普[1-2]、英夫利西[3-4]和阿達木單抗[5]等屬于生物制劑類DMARDs，可有效抑制關節(jié)炎性反應、改善預后。

盡管TNF抑制劑療效顯著，但仍有約20%的患者治療反應不佳[2-3]。由于生物制劑在我國價格昂貴，故尋找可預測治療有效性及判斷療效的生物標志物對正確合理應用該類藥物有重要意義[6]。研究自身免疫性疾病的發(fā)病、病情和療效相關的生物標志物的方法很多，其中蛋白指紋圖譜的表達是一種重要手段。關于RA生物治療的蛋白組學研究國外報道較少[7-9]，而檢索中國醫(yī)院數字圖書館，尚未發(fā)現(xiàn)相關文獻。本研究通過蛋白指紋圖譜篩選英夫利西單抗治療RA患者前后小分子蛋白的表達情況，為尋找可判斷TNF抑制劑有效性的生物標志物提供一定依據。

對象和方法

研究對象

2010年至2011年北京協(xié)和醫(yī)院確診的RA患者17例，診斷標準符合2010年美國風濕病學會歐洲風濕病學聯(lián)盟的RA診斷標準[10]；且傳統(tǒng)DMARDs治療效果不佳，按照RA疾病活動評分(disease activity score 28，DAS28)病情為中度和重度活動(DAS28>3.2)。該研究經北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會批準，每例患者均簽署知情同意書。

臨床療效評價

療效指標包括腫脹關節(jié)數、觸痛關節(jié)數、紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate， ESR)、C反應蛋白(C reactive protein，CRP)、DAS28、患者健康評估問卷(health assessment questionnaire，HAQ)。療效判斷根據DAS28下降分值，治療后DAS28下降≥30%者臨床判斷為有效，DAS28下降<30%者臨床判定為無效。

方法

給藥方法：治療第0、2、6、14、22周給予RA患者英夫利西單抗靜脈滴注，共5次，每次劑量200 mg。

血清樣品：留取患者治療前、治療14和26周的外周血標本。所有標本均采用4 ml無抗凝劑的BD真空采血管空腹采血后于4℃靜置1 h，4000×g離心5 min。血清分裝5管，于―80℃凍存?zhèn)溆?。弱陽離子(WCX)納米磁性微球，購自北京賽爾迪生物技術有限公司。乙腈、三氟乙酸、尿素、Hepes、水(HPLC級)、Tris堿、CHAPS、DTT、Sinapinic acid(SPA)購自Sigma公司。PBSII-C型蛋白質芯片閱讀儀為美國賽弗吉公司產品。

標本準備：血清融化后4℃，20 000×g離心10 min。取10 μl血清，加20 μl的U9緩沖液(9 molL尿素、20 gL CHAPS、10 gL DTT、50 mmolL Tris-HCl、pH值9.0)，4℃振搖30 min后加入100 mmolL NaAc 370 μl(pH值4.0)，混勻。

統(tǒng)計學處理

采用Ciphergen ProteinChip軟件和BioMarker Wizard軟件對蛋白指紋圖譜進行統(tǒng)計學處理。治療前后蛋白質峰的比較采用t檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。蛋白質峰值與臨床炎性指標相關性采用Pearson相關系數進行分析。

結　　果

英夫利西單抗治療前后RA患者一般資料及療效評估

納入本研究的17例RA患者均為女性，年齡 20～59歲，平均(43±12)歲；病程6～48個月，平均(25±21)月。所有患者治療前DAS28評分均為中至重度活動。治療前(第0周)、治療中(第14周)和治療后(第26周)主要臨床指標見表1。治療后DAS28下降>30%者13例(76.5%)，臨床判斷為治療有效；4例(23.5%)患者DAS28下降<30%，臨床判定為療效不佳。

英夫利西單抗治療前后患者血清蛋白組學變化

治療后血清水平下降的小分子蛋白：治療有效的13例患者治療后血清蛋白組學檢測發(fā)現(xiàn)共有10種小分子蛋白的血清水平下降，這10種小分子蛋白分別為mz 8209.4、mz 3303.6、mz 9014.3、mz 8688.2、mz 5851.0、mz 6917.6、mz 4340.5、mz 4514.9、mz 5056.1和mz 10 741.3(表2)。治療中(第14周)、治療后(第26周)與治療前(第0周)蛋白質峰相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1A、C)。上述10種蛋白下降水平與DAS28、ESR和CRP下降呈平行關系，相關性分析具有正相關性。4例療效不佳者治療前(第0周)、治療中(第14周)和治療后(第26周)上述10種小分子蛋白的表達水平無顯著性變化(P>0.05)(圖1B、D)。

治療后血清水平上升的小分子蛋白：經英夫利西單抗治療后檢測血清蛋白水平，發(fā)現(xiàn)所有17例患者均有2種小分子蛋白水平上升，分別為mz 5 382.4和mz 5 960.2(圖2)，治療前(第0周)、治療中(第14周)和治療后(第26周)上述蛋白表達水平的變化差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表3)。

表1　英夫利西單抗治療前后類風濕關節(jié)炎患者主要臨床指標改變Table 1　Comparison of clinical and laboratory parameters in rheumatoid arthritis patients before and after inflimimab treatment

DAS28：病情活動評分；ESR：紅細胞沉降率；CRP：C反應蛋白；HAQ：健康評估問卷；w 0：治療前(第0周)；w14：治療中(第14周)；w26：治療后(第26周)

表2英夫利西單抗治療后臨床改善的RA患者血清水平下降的蛋白質峰

Table2Down-regulated serum protein peaks in RA patients during inflimimab treatment

用藥時間m∕z8209 4m∕z3303 6m∕z9014 3m∕z8688 2m∕z5851 0m∕z6917 6m∕z4340 5m∕z4514 9m∕z5056 1m∕z10741 3治療前(第0周)37 25±25 5318 67±7 8159 51±14 6528 87±14 4514 36±7 6824 29±13 9421 24±5 9720 84±4 967 49±9 383 46±4 08治療中(第14周)9 81±4 493 99±3 0624 39±13 979 38±7 072 63±2 515 89±4 5211 04±5 1611 76±6 790 57±0 320 20±0 25治療后(第26周)8 87±5 966 63±5 4222 53±15 529 88±4 034 32±3 317 75±6 9410 59±3 8910 66±4 510 83±0 740 36±0 28P值0 00130 00170 00220 00230 00320 00390 00420 00620 00750 0092

RA：類風濕關節(jié)炎

表3英夫利西單抗治療后RA患者血清水平升高的蛋白質峰

用藥時間m∕z5382 4m∕z5960 2治療前(第0周)2 65±3 083 54±5 18治療中(第14周)15 21±12 2138 23±30 79治療后(第26周)14 22±6 8324 78±15 93P值0 00140 0017

RA：類風濕關節(jié)炎；mz：質荷比

討　　論

TNF抑制劑是新型治療RA的生物制劑，目前已用于治療傳統(tǒng)藥物療效不佳的患者。判斷生物制劑療效的血清學生物標志物除ESR及CRP外，還有致炎性細胞因子水平等。然而，由于此類生物制劑的價格昂貴，在國內較難廣泛應用，從藥效經濟學角度看，如能發(fā)現(xiàn)預測生物治療療效的生物標志物或將極大程度地減輕患者的經濟負擔，更有效地選擇藥物，改善病情和改善預后。因此，尋找能夠反映生物制劑療效的新的生物標志物的研究一直在進行。

研究自身免疫病發(fā)病、病情和療效相關的生物標志物的方法學有許多種，其中蛋白指紋圖譜的表達研究是了解自身免疫病的重要突破口。近年來，蛋白組學的研究快速發(fā)展，涌現(xiàn)了大量蛋白組學的研究方法并應用于多種臨床疾病，風濕免疫病中也有許多相關研究，如關于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬化等自身免疫病已發(fā)現(xiàn)了許多與發(fā)病機制相關的生物標志物[11-13]。

圖1英夫利西單抗治療后RA患者血清水平下降的蛋白質指紋圖譜

Fig1Expression of down-regulated serum protein in RA patients during Inflimimab treatment by MALDI-TOFMS analysis

RA：類風濕關節(jié)炎

圖2英夫利西單抗治療后RA患者血清水平升高的蛋白質指紋圖譜

Fig2Expression of up-regulated serum proteins in RA patients during Inflimimab treatment by MALDI-TOFMS analysis

RA：類風濕關節(jié)炎

盡管TNF抑制劑治療RA已被廣泛接受，但利用蛋白組學技術發(fā)現(xiàn)與TNF抑制劑治療RA相關的生物標志物的研究并不多。Takeuchi等[8]通過2D膠蛋白組學研究發(fā)現(xiàn)，使用英夫利西治療后，患者血清中下降的蛋白分子包括CRP、血清淀粉樣蛋白A、血清淀粉樣蛋白P及α-酸糖蛋白，治療后升高的有視黃素結合蛋白、維生素D結合蛋白以及凝溶膠蛋白。Sekigawa等[9]利用二維液相色譜串聯(lián)質譜法(2D LC-MS/MS)檢測了TNF抑制劑治療后RA患者血清或血漿中與核轉錄因子(NF-kB)及關節(jié)軟骨代謝相關的蛋白水平發(fā)生改變。目前尚未發(fā)現(xiàn)利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)技術進行相關研究的文章。

本研究利用MALDI-TOF-MS技術分析經過英夫利西單抗治療前后RA患者血清蛋白指紋，旨在發(fā)現(xiàn)與療效相關的血清中小分子多肽。本研究發(fā)現(xiàn)，治療有效組患者m/z為8209.4、3303.6、9014.3、8688.2、5851.0、6917.6、4340.5、4514.9、5056.1和10 741.3的蛋白峰在治療后隨病情好轉而呈進行性下降，且與DAS28、ESR和CRP水平呈正相關；治療無效的患者上述小分子蛋白則無上述變化。m/z為5382.5和5960.2的蛋白峰，無論針對治療有效患者還是無效患者均在治療后呈進行性上升。根據上述結果筆者推測，治療后血清水平呈下降及上升的這兩類蛋白質分子可能參與了RA的病情進展，治療前高表達的蛋白促進炎性反應，在治療后下降；而治療前低表達的蛋白可能為抑制炎性的因子，治療后上升。另外，可以根據此結果判斷患者對TNF抑制劑的治療是否有反應，如治療前上述隨治療而下降的蛋白為低表達，則表明該患者可能而對治療反應不佳。

[1]Wiens A, Correr CJ, Pontarolo R, et al. A systematic review and meta-analysis of the efficacy and safety of etanercept for treating rheumatoid arthritis[J]. Scand J Immunol, 2009, 70：337-344.

[2]張文, 史群, 吳東海, 等. 英夫利昔單抗多中心臨床觀察[J]. 中華醫(yī)學雜志, 2009, 89：1876-1880.

[3]Goekoop-Ruiterman YP, de Vries-Bouwstra JK, Allaart CF, et al. Clinical and radiographic outcomes of four different treatment strategies in patients with early rheumatoid arthritis (the BeSt study)： a randomized, controlled trial[J]. Arthritis Rheum, 2008, 58：126-135.

[4]Wiens A, Correr CJ, Venson R, et al. A meta-analysis of the efficacy and safety of using infliximab for the treatment of rheumatoid arthritis[J]. Clin Rheumatol, 2009, 28：1365-1373.

[5]黃烽, 張奉春, 鮑春德, 等. 阿達木單抗聯(lián)合甲氨蝶呤治療類風濕關節(jié)炎的多中心、隨機、雙盲、安慰劑對照臨床研究[J]. 中華內科雜志, 2009, 48：916-921.

[6]Prajapati R, Plant D, Barton A. Genetic and genomic predictors of anti-TNF response[J]. Pharmacogenomics, 2011, 12：1571-1585.

[7]王梅，劉素苗，張莉蕓.類風濕關節(jié)炎蛋白組學研究進展[J].中華臨床免疫和變態(tài)反應雜志，2012，6：308-312.

[8]Takeuchi T, Kotani T, Nakanishi T, et al. Proteomic analysis of changes in the serum protein profile by anti-TNF-alpha therapy[J]. Rinsho Byori, 2010, 58：332-336.

[9]Sekigawa I, Yanagida M, Iwabuchi K, et al. Protein biomarker analysis by mass spectrometry in patients with rheumatoid arthritis receiving anti-tumor necrosis factor-alpha antibody therapy[J]. Clin Exp Rheumatol, 2008, 26：261-267.

[10] Aletaha D, Neogi T, Silman AJ, et al. 2010 Rheumatoid arthritis classification criteria： an American College of RheumatologyEuropean League Against Rheumatism collaborative initiative[J]. Ann Rheum Dis, 2010, 69：1580-1588.

[11] 胡朝軍, 李永哲. 蛋白質指紋圖譜技術在疾病研究中的應用[J]. 臨床檢驗雜志, 2008, 26：227-229.

[12] 黃卓春, 石運瑩, 蔡蓓, 等. 運用蛋白質指紋圖譜技術建立系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷模式的研究[J]. 四川大學學報(醫(yī)學版), 2009, 40：499-503.

[13] 胡朝軍, 李永哲, 趙冠飛, 等. 應用蛋白指紋圖譜技術篩選原發(fā)性膽汁性肝硬化患者血清特異性標志物[J]. 世界華人消化雜志, 2008, 16：277-283.