毛彩艷 申元英袁芝瓊 陳紅云 季守蓮 林麗佳

大理學院，云南 大理 671003

采收于春、秋季云南雞屎藤根體外抗菌對比研究

毛彩艷 申元英*袁芝瓊 陳紅云 季守蓮 林麗佳

大理學院，云南 大理 671003

目的：了解采收于春、秋季云南雞屎藤根對四種實驗菌的體外抗菌作用。方法：采集于春、秋季的云南雞屎藤根的水提取液，用試管稀釋法、平板計數法對金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌進行體外抑菌、殺菌實驗。結果：春季采云南雞屎藤根對金黃色葡萄球菌（25922）的抑菌作用最強，對綠膿桿菌（ATCC27853）的殺菌作用最強，其對金黃色葡萄球菌（25922）的抑菌作用、大腸桿菌 （25923）的抑菌、殺菌作用優(yōu)于秋季采云南雞屎藤根。秋季采云南雞屎藤根對痢疾桿菌 （2a24577）的抑菌作用最強，對綠膿桿菌的殺菌作用最強，其對痢疾桿菌（2a24577）、綠膿桿菌（ATCC27853）的抑菌、殺菌作用，對金黃色葡萄球菌（25922）的抑菌作用均優(yōu)于春季采云南雞屎藤根。結論：采集于春、秋兩季的云南雞屎藤根的水提取液對四種實驗菌均具有抑菌、殺菌作用。針對不同的致病菌感染導致的疾病，應選擇不同季節(jié)采收的云南雞屎藤根治療。

春、秋季采收；云南雞屎藤根；體外抗菌；對比研究

中草藥的來源、產地、采收季節(jié)、炮制加工、煎煮方法的不同，會影響藥物有效成分及有效成分的含量，最終都會影響其臨床療效［1］。雞屎藤［Paederia scandens（Lour.）Merr］，又名斑鳩飯、女青、牛皮凍、臭藤、雞矢藤等，主要分布在南亞、東北亞、東南亞各國。藥材用雞屎藤主產云南、貴州、四川、廣西、廣東、福建、安徽、江蘇等?。?］。雞屎藤根在中醫(yī)臨床中常用于治療消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及皮膚感染性疾病［3－7］。雞屎藤根是雞屎藤的主要用藥部位，其采收季節(jié)的不同，將直接影響其有效成份的含量及對疾病的治療效果［8］。為了解采收于春、秋季節(jié)云南雞屎藤根對消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及皮膚感染性疾病常見致病菌痢疾桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的體外抗菌作用，作者對分別于春、秋兩季采收于云南滇中的雞屎藤根的水提取液對以上四種實驗菌的體外抗菌作用進行了對比研究。

1 材料

1.1 藥材 雞屎藤根：采集于云南滇中地區(qū)大姚縣城西郊坡地，由大理學院藥學與化學學院馬曉匡教授鑒定為云南雞屎藤根。把所采集到的雞屎藤根泥土洗凈，切片曬干后用中藥粉碎機粉碎過40目篩，把粉碎后的雞屎藤根置于40℃恒溫干燥箱內干燥到恒重，收集于密閉保鮮袋常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗菌株 實驗所用菌株金黃色葡萄球菌（25922）、痢疾桿菌（2a24577）、大腸桿菌（25923）、綠膿桿菌（ATCC27853），以上菌種均為標準菌，取自大理學院基礎醫(yī)學院病原微生物實驗室。

1.3 實驗儀器 旋轉蒸發(fā)器（RE－52A，上海亞榮生化儀器廠生產）；SHZ－D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 （鞏義市子華儀器有限責任公司）；高速中藥粉碎機（DFY－600）；干燥箱、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、定量濾紙 （快速201，灰分：0.01）、酶標儀、96孔板、高壓滅菌鍋等。

2 方法

2.1 實驗藥液的制備 稱取雞屎藤根各100g，分別加入500m l超純水浸泡30min，煮沸后文火煎20min，各煎煮3次，把3次水煎液濾出混合后用定量濾紙過濾，將濾液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮得浸膏春季采收雞屎藤根13g，秋季采收雞屎藤根14g。把所得浸膏120℃高壓滅菌20min后用無菌水稀釋到1g/ml置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 實驗菌液的制備 從保種斜面上挑取菌苔劃線接種到營養(yǎng)瓊脂平板，置于恒溫培養(yǎng)箱37℃下培養(yǎng)18h，挑取單個菌落接種到5ml肉湯中，在恒溫培養(yǎng)箱37℃下培養(yǎng)18h，取出置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 實驗菌的濃度計算 用麥氏比濁法得出實驗菌細菌濃度標準曲線公式為：y＝41.658x＋0.5502，R2＝0.9985。把制備好的菌液搖勻后，吸取1ml，用生理鹽水作10倍順序稀釋為10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6搖勻，用移液槍吸取300μl順序放入已讀取過空白板吸光度值的96孔板的微孔里，另吸取300μl生理鹽水作為對照，作好標記［9－10］。用酶標儀讀出不同濃度菌液的吸光度，把吸光度數值帶入標準曲線公式算出細菌濃度，取濃度為105cfu/ml的菌液為實驗菌。

2.4 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測定 用試管稀釋法測定分別采集于春、秋兩季的云南雞屎藤根對四個實驗菌的最低抑菌濃度 （MIC）和最低殺菌濃度（MBC）。取10支滅菌有塞試管，分別加入營養(yǎng)肉湯1ml，在第1管中加入實驗藥液1ml，混勻后吸取1ml加入到第2管中，第二管按同樣方法混勻后吸取1ml加入到第3管，依次稀釋到第9管，第9管混勻后棄去1ml，第10管不加藥液作對照［11］。各管分別加入試驗菌液0.1m l，混勻置于恒溫培養(yǎng)箱37℃下培養(yǎng)18h，肉眼觀察無細菌生長的藥液最低濃度為最低抑菌濃度 （MIC）。測出最低抑菌濃度（MIC）后，再依次從無細菌生長的各管中吸取0.1m l培養(yǎng)物分別接種于營養(yǎng)瓊脂平板，置于恒溫培養(yǎng)箱37℃下培養(yǎng)18－24h，數平板上生長的菌落數小于5個的藥液最低濃度為最低殺菌濃度 （MBC）［12］。

3 結果與分析

3.1 兩個實驗藥對四種實驗菌的最低抑菌濃度（MIC）采集于春、秋季云南雞屎藤根的水提取液抗四種試驗菌的抑菌作用及最低抑菌濃度（MIC）見附表1。對表1中數據進行分析可發(fā)現，兩種實驗藥對四種實驗菌均有抑菌作用，春季采云南雞屎藤根水提取液對金黃色葡萄球菌 （25922）的抑菌作用最強，其MIC為0.0000769mg/ml，對痢疾桿菌（2a24577）、大腸桿菌（25923）、綠膿桿菌（ATCC27853）的抑菌作用相當，其MIC均為0.769mg/ml。秋季采云南雞屎藤根對痢疾桿菌（2a24577）的抑菌作用最強，其MIC為0.0714mg/ml，對金黃色葡萄球菌（25922）和綠膿桿菌（ATCC27853）的抑菌作用次之，其MIC為0.714mg/ml，對大腸桿菌（25923）的抑菌作用最差，其MIC為7.14mg/ml。對比發(fā)現春季采云南雞屎藤根水提取液對金黃色葡萄球菌（25922）、大腸桿菌（25923）的抑菌作用有突出優(yōu)勢。秋季采云南雞屎藤根水提取液對痢疾桿菌（2a24577）、綠膿桿菌（ATCC27853）的抑菌作用有突出優(yōu)勢。

表1 采收于春、秋季云南雞屎藤根水提取液對4種實驗菌的最低抑菌濃度 （MIC）

3.2 兩個實驗藥對四種實驗菌的最低殺菌濃度（MBC）采集于春、秋兩季云南雞屎藤根的水提取液對四種試驗菌的殺菌作用及最低殺菌濃度（MBC）見附表2。對表2中數據分析可發(fā)現，春、秋季采云南雞屎藤根水提取液對四種實驗菌均有殺菌作用，并且它們對綠膿桿菌（ATCC27853）的殺菌作用相比其它實驗菌均較強，其MBC分別為7.69mg/m l、7.14mg/m l，春季采云南雞屎藤根水提取液對大腸桿菌 （25923）的殺菌作用有突出優(yōu)勢，其MBC為76.9mg/m l。秋季采云南雞屎藤根水提取液對痢疾桿菌（2a24577）的殺菌作用有突出優(yōu)勢，其MBC為71.4mg/ml。兩個實驗藥對金黃色葡萄球菌（25922）的殺菌作用相比其它實驗菌均較弱。

表2 采收于春、秋季云南雞屎藤根水提取液對4種實驗菌的最低殺菌濃度 （MBC）

4 討論

通過對采集于春、秋季云南雞屎藤根的水提取液對四種實驗菌的體外抑菌、殺菌作用的實驗數據分析得出，采集于春、秋兩季的云南雞屎藤根的水提取液對四種實驗菌均具有抑菌、殺菌作用。對四種實驗菌的抑菌、殺菌作用相比較，春季采云南雞屎藤根對金黃色葡萄球菌 （25922）的抑菌作用最強，對綠膿桿菌（ATCC27853）的殺菌作用最強，其對金黃色葡萄球菌 （25922）的抑菌作用、大腸桿菌 （25923）的抑菌、殺菌作用優(yōu)于秋季采云南雞屎藤根。秋季采云南雞屎藤根對痢疾桿菌（2a24577）的抑菌作用最強，對綠膿桿菌的殺菌作用最強，其對痢疾桿菌（2a24577）、綠膿桿菌（ATCC27853）的抑菌、殺菌作用、對金黃色葡萄球菌 （25922）的抑菌作用均優(yōu)于春季采云南雞屎藤根。數據分析結果表明，在用云南雞屎藤根治療由痢疾桿菌感染引起的疾病時，宜首選秋季采挖的雞屎藤根，治療由大腸桿菌感染引起的疾病時，宜首選春季采挖的雞屎藤根。兩個季節(jié)采挖的雞屎藤根均適宜用于治療由金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌感染引起的疾病，并且對綠膿桿菌感染引起的疾病的治療效果更優(yōu)。所以，為了提高藥物的臨床療效，在用云南雞屎藤水煎液治療以上四種實驗菌感染而引起的感染性疾病時，我們應根據不同的致病菌，選擇不同季節(jié)采收的云南雞屎藤治療。

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R285.5

A

1007－8517（2013）08－0006－02

2013.03.12）

大理學院青年教師科研基金資助項目 （編號：KYQN2010－58）；2、“云南省藥用昆蟲及蛛形類資源開發(fā)利用工程實驗室”建設項目。

毛彩艷，女，（1981－），研究實習員，研究領域：中西醫(yī)結合臨床、流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學、管理學；研究方向：分子流行病學、藥物流行病學、高校管理。

*通訊作者：申元英，女，（1963－），職稱：教授研究領域：感染性疾病及傳染?。慌R床醫(yī)學；基礎醫(yī)學；研究方向：醫(yī)學微生物與免疫學研究。