王麗，陶興寶，歐陽(yáng)凈，楊鐘平

(重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心，重慶 400036)

痢疾桿菌(Shigella dysenteriae)又稱(chēng)志賀氏菌，為革蘭氏陰性菌，無(wú)芽孢、無(wú)鞭毛，耐寒?？梢栽谄胀ㄅ囵B(yǎng)基上生長(zhǎng)，形成中等大小、半透明的光滑菌落[1]。痢疾桿菌是導(dǎo)致人類(lèi)及靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物感染細(xì)菌性痢疾最為常見(jiàn)的病原菌，感染之后會(huì)出現(xiàn)以腹痛、腹瀉、發(fā)熱為特征的典型癥狀[2]。細(xì)菌性痢疾在我國(guó)被劃歸為乙類(lèi)傳染病，根據(jù)衛(wèi)生部《全國(guó)細(xì)菌性痢疾監(jiān)測(cè)方案》中報(bào)道，全球每年感染人次約為1.65億，發(fā)達(dá)國(guó)家細(xì)菌性痢疾發(fā)病率約為1.8～6.5/10萬(wàn)，我國(guó)發(fā)病率為15.29/10萬(wàn)[3],明顯高于其他發(fā)達(dá)國(guó)家。隨著抗菌藥物的廣泛使用，痢疾桿菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性大幅提高，細(xì)菌性痢疾的防治日趨困難。我國(guó)傳統(tǒng)的中草藥價(jià)格低廉、毒副作用小、耐藥性低，越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)外研究者從中草藥中篩選抗菌藥物，探究其抑菌作用[4]。本文主要對(duì)白頭翁湯對(duì)痢疾桿菌體外抑菌效果進(jìn)行研究，旨在為防治細(xì)菌性痢疾提供用藥參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和菌株來(lái)源

白頭翁、黃連、黃柏和秦皮購(gòu)置于本院中藥房。痢疾桿菌由本院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要儀器和試劑

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、無(wú)菌操作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、紫外分光光度計(jì)、電導(dǎo)率儀等。主要試劑：蛋白胨、牛肉膏、瓊脂、氯化鈉、蒸餾水等，由本院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)基的制備

液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)整pH值至7.4。固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，瓊脂18 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)整pH值至7.4。

1.2.2 白頭翁湯水相提取物的制備

稱(chēng)取白頭翁150 g,黃柏120 g,黃連60 g和秦皮120 g加10倍蒸餾水于圓底燒瓶中，浸泡60 min后加熱回流60 min，用紗布趁熱過(guò)濾。藥渣再分別加入8倍量蒸餾水和6倍量蒸餾水重復(fù)上述操作，合并濾液，減壓濃縮成生藥濃度為0.1 g/mL的藥液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 痢疾桿菌懸液的制備

在37 ℃條件下將痢疾桿菌菌種于24 h內(nèi)反復(fù)活化3代，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。加入液體培養(yǎng)基稀釋制成含菌量為106cfu/mL的菌懸液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹5]。

1.2.4 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

將試管按順序編號(hào)后置于試管架上，每管內(nèi)加入2.0 mL無(wú)菌液體培養(yǎng)基，然后在第1管中加入2.0 mL滅菌的白頭翁水提取物，混合均勻后取出2.0 mL加入第2管中，重復(fù)前述操作，直至第7管中取出2.0 mL液體丟棄，第8管作為陽(yáng)性對(duì)照，不加入藥液，以觀察培養(yǎng)基是否適宜細(xì)菌生長(zhǎng)。第9管中不加菌液，加入2.0 mL白頭翁水提取物，作為陰性對(duì)照，以觀察受試藥液是否被污染。1～7號(hào)試管藥液濃度分別為 128、64、32、16、8、4、2 mg/mL、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。然后向1～8號(hào)試管中分別加入0.1 mL痢疾桿菌菌懸液，混合均勻后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。如肉湯混濁，則表示細(xì)菌生長(zhǎng)，如肉湯完全清亮，則表示無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥液濃度作為白頭翁湯對(duì)痢疾桿菌的MIC。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 最低殺菌濃度(MBC)的測(cè)定

吸取0.1 mL無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的各試管中培養(yǎng)液，接種到無(wú)藥液的瓊脂培養(yǎng)基上，輕輕推開(kāi)，于37 ℃下培養(yǎng)。觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)基中無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為白頭翁湯的MBC。

1.2.6 白頭翁湯作用下細(xì)菌細(xì)胞膜電導(dǎo)率的測(cè)定

將痢疾桿菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后接種到液體培養(yǎng)基中，并加入稀釋后的白頭翁湯水相提取物，使終濃度分別為32、64 mg/mL，此為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組1為不加乙醇的溶液，對(duì)照組2為添加等體積乙醇的溶液。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別搖床培養(yǎng)，在0，2，4，6，8 h取菌液，在轉(zhuǎn)速為5 000 r/min下離心10 min，取其上清液，并用去離子水稀釋20倍，測(cè)定稀釋后的上清液電導(dǎo)率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值[6]。

1.2.7 細(xì)菌DNA含量檢測(cè)

將痢疾桿菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后接種到培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)液中白頭翁湯的終濃度為2，4，6，8，16 mg/mL，選擇無(wú)菌水為空白對(duì)照組，于37 ℃、130 rpm搖床中培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后分別取樣品2 mL，轉(zhuǎn)速為4 000 rpm條件下離心10 min，取上清液。用紫外分光光度計(jì)測(cè)上清液中DNA大分子的吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.8 對(duì)蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)和琥珀酸脫氫酶(SDH)活性的影響

將2.5 mL Tris-HC(0.1 mol/L,pH值8.8)、0.1 mL蘋(píng)果酸鈉(0.1 mmol/L)、0.1 mL輔酶Ⅰ(10 mmol/L)依次加入石英比色皿中，快速加入粗酶液0.3 mL，引發(fā)反應(yīng)。在340 nm波長(zhǎng)下，每隔0.5 min用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定,連續(xù)3 min，以時(shí)間t(min)為橫坐標(biāo)、A340 nm為縱坐標(biāo)作圖，取整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中的線(xiàn)性部分來(lái)計(jì)算A340 nm/min的增殖，以每min A值增加0.01作為1個(gè)酶活力單位。用小牛血清蛋白對(duì)照，測(cè)定粗酶液中MDH的含量，按照公式求出MDH的比活性;SDH活性按試劑盒的操作步驟進(jìn)測(cè)定。以小血清蛋白為對(duì)照，測(cè)定粗酶液中SDH的含量，按照公式求出SDH的比活性[7]。

MDH的比活性[U/(min·mg)]=(ΔA/0.01)/(反應(yīng)時(shí)間×樣品蛋白含量)

SDH比活性(U/mg)=酶活性/樣品蛋白含量

2 結(jié)果

2.1 白頭翁湯的最小抑菌濃度(MIC) 和最低殺菌濃度(MBC)

將體外抑菌及最小抑菌濃度的測(cè)定時(shí)間分別設(shè)為12 h和24 h， 利用白頭翁湯水提取物的母液，分別將白頭翁湯水提物稀釋到2、4、6、8、16、32、64、128 mg/mL等梯度濃度，觀察白頭翁湯水提取物對(duì)痢疾桿菌的抑制作用，結(jié)果顯示，其最小抑菌濃度MIC大概為32 mg/mL，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，結(jié)果相同。參考五倍子、金銀花、穿心蓮等中藥的MIC在125以上，表明白頭翁湯水提物對(duì)痢疾桿菌具有較好的抑菌作用。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 白頭翁湯提取物對(duì)痢疾桿菌MIC測(cè)定結(jié)果

進(jìn)一步利用白頭翁湯水相提取物的母液，分別將白頭翁湯水相提取物稀釋到2、4、6、8、16、32、64、128 mg/mL等梯度濃度，觀察白頭翁湯水提取物對(duì)痢疾桿菌的殺菌作用，結(jié)果顯示，其最小殺菌濃度MBC大概為64 mg/mL，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，結(jié)果相同。參考五倍子、金銀花、穿心蓮等中藥的MBC在220以上，表明白頭翁湯水相提取物對(duì)痢疾桿菌具有較好的殺菌作用。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 白頭翁湯提取物對(duì)痢疾桿菌MBC測(cè)定

2.2 白頭翁湯水相提取物對(duì)痢疾桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響

為了進(jìn)一步明確白頭翁湯水相提取物對(duì)痢疾桿菌的影響，采取梯度濃度殺菌/抑菌檢測(cè)法對(duì)白頭翁湯的作用進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，陰性對(duì)照(即不加白頭翁湯)對(duì)痢疾桿菌生長(zhǎng)無(wú)作用，細(xì)菌出現(xiàn)了明顯的指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，采取MIC濃度的白頭翁湯作用后(即32 mg/mL)，痢疾桿菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)出現(xiàn)了明顯的抑制；采取MBC濃度的白頭翁湯作用后(即64 mg/mL)，痢疾桿菌出現(xiàn)了明顯的殺滅效應(yīng)，而且效應(yīng)存在明顯的時(shí)間梯度依賴(lài)性。這一結(jié)果表明，白頭翁湯水相提取物對(duì)痢疾桿菌具有良好的抑菌和殺菌作用。見(jiàn)圖1。

圖1 白頭翁湯水相提取物對(duì)痢疾桿菌的殺菌/抑菌曲線(xiàn)

2.3 測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞膜的電導(dǎo)率

細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供了相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，同時(shí)參與細(xì)胞與周?chē)h(huán)境中的物質(zhì)交換，保持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡。添加藥物會(huì)對(duì)細(xì)胞膜的滲透性產(chǎn)生一定影響，表現(xiàn)為培養(yǎng)基電導(dǎo)率的改變。研究顯示，與對(duì)照組相比，白頭翁湯組隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)及溶液濃度增加，電導(dǎo)率也顯著增加，由此可見(jiàn)細(xì)菌體內(nèi)有電解質(zhì)滲出，表明白頭翁湯可能破壞痢疾桿菌的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，從而抑制其生長(zhǎng)。見(jiàn)圖2。

圖2 白頭翁湯水相提取物對(duì)痢疾桿菌電導(dǎo)率的影響

2.4 白頭翁湯作用痢疾桿菌后DNA含量的變化

細(xì)菌DNA含量是評(píng)價(jià)細(xì)菌活性和致病力的重要指標(biāo)，筆者利用白頭翁湯水相提取物的母液，分別將白頭翁湯水相提取物稀釋到2、4、6、8、16 mg/mL等梯度濃度，觀察白頭翁湯水相提取物對(duì)痢疾桿菌DNA含量的影響，OD值測(cè)定結(jié)果顯示，隨著濃度梯度的增高，痢疾桿菌DNA含量逐漸降低，并呈現(xiàn)出濃度依賴(lài)性，這一結(jié)果表明，白頭翁湯水相提取物可以明顯降低痢疾桿菌DNA含量。見(jiàn)圖3。

圖3 白頭翁湯水相提取物對(duì)痢疾桿菌DNA含量的影響

2.5 白頭翁湯對(duì)蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)和琥珀酸脫氫酶(SDH)活性的影響

蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)和琥珀酸脫氫酶(SDH)是呼吸代謝中的關(guān)鍵酶，MDH和SDH的活性強(qiáng)弱可反映對(duì)細(xì)菌呼吸代謝的影響，研究結(jié)果見(jiàn)圖4及圖5。由圖可見(jiàn)，在不同時(shí)間段，實(shí)驗(yàn)組MDH、SDH的比活性均明顯低于空白組，但不同濃度組的比活性無(wú)明顯變化。以上結(jié)果表明，白頭翁湯提取物可以降低痢疾桿菌的蘋(píng)果酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶的活性，影響細(xì)胞的呼吸代謝，從而影響細(xì)菌的正常繁殖。

圖4 白頭翁湯對(duì)蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)活性的影響

圖5 白頭翁湯對(duì)琥珀酸脫氫酶(SDH)活性的影響

3 討論

白頭翁湯其組方及煎服法：白頭翁二兩，黃連(去須)三兩，黃柏(去皮)三兩，秦皮三兩，上四味，以水七升，煮取二升，去滓溫服一升，不愈更服一升。該方組方嚴(yán)謹(jǐn)，具有清熱解毒、涼血止痢等作用，主治濕熱諸疾。方中白頭翁為君，清熱解毒、涼血止痢；黃連、黃柏、秦皮為臣，清熱燥濕、瀉火解毒。四藥并用，可以加強(qiáng)清熱止痢之功，為熱毒血痢之良方，在臨床中應(yīng)用非常廣泛[8]。目前該方臨床主要用于治療細(xì)菌性痢疾、阿米巴痢疾等癥，尤其對(duì)于細(xì)菌性痢疾該方常作為治療的首選方劑[9]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白頭翁湯劑對(duì)細(xì)菌有明顯抑制作用,能殺滅阿米巴原蟲(chóng)和陰道滴蟲(chóng)。故可用于相關(guān)感染性疾病的治療，如細(xì)菌性痢疾、阿米巴痢疾、滴蟲(chóng)性陰道炎、泌尿道感染、阿米巴肝膿瘍、急慢性盆腔炎、霉菌等[8]。

細(xì)菌性痢疾是痢疾桿菌引起的腸道傳染病。痢疾桿菌經(jīng)消化道感染人體后，引起結(jié)腸黏膜的炎癥和潰瘍，并釋放毒素入血，使感染者出現(xiàn)腹瀉、腹痛、里急后重的癥狀，該疾病在夏秋季發(fā)病率較高[10]，是我國(guó)的常見(jiàn)病、多發(fā)病，兒童和青壯年是高發(fā)人群。近年來(lái)，國(guó)家不斷加大對(duì)衛(wèi)生投入，以及抗菌藥物的廣泛使用，細(xì)菌性痢疾發(fā)病率和病死率都明顯下降。但由于抗菌藥物的濫用，耐藥菌不斷出現(xiàn)，導(dǎo)致該病發(fā)病率仍然處于較高水平，并且常有局部暴發(fā)流行的報(bào)道，給該病的防控及治療帶來(lái)了挑戰(zhàn)。臨床中常采用白頭翁湯通過(guò)抑制痢疾桿菌治療細(xì)菌性痢疾，療效顯著，作用可靠，對(duì)縮短病程，控制傳染源，減少細(xì)菌性痢疾的發(fā)生具有重要意義。

目前的研究表明，中醫(yī)藥抑菌作用機(jī)制一般為改變細(xì)菌細(xì)胞膜、細(xì)胞壁通透性，通過(guò)抑制蛋白質(zhì)、核酸表達(dá)及三羧酸循環(huán)，從而擾亂菌體生理代謝而實(shí)現(xiàn)抑菌或殺菌[11]。Yang等[12]通過(guò)阻滯凝膠電泳和原子力顯微鏡分析枯草芽孢桿菌DNA 與10-HAD的結(jié)合，探究10-HAD抑制枯草芽孢桿菌的抑菌機(jī)制，結(jié)果顯示枯草芽孢桿菌的DNA與10-HAD有很強(qiáng)的結(jié)合力。Li等[13]通過(guò)流式檢測(cè)P7對(duì)大腸桿菌細(xì)胞周期的影響，研究其對(duì)大腸桿菌抑菌機(jī)制，結(jié)果顯示P7可阻滯大腸桿菌細(xì)胞周期的S期，使細(xì)胞周期發(fā)生紊亂，從而達(dá)到抑菌作用。Dwyer等[14]研究發(fā)現(xiàn)抗生素能夠使細(xì)菌發(fā)生生理性細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能為抗生素作用菌體后使活性氧含量急劇上升。Dorsey-Oresto等[15]的研究表明，抑菌劑可以抑制Yih E基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的抑制作用。

本研究對(duì)白頭翁湯的抑菌機(jī)制進(jìn)行了初步探討，但其在人體中的作用如何，還需要新一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。另外，筆者研究主要是針對(duì)白頭翁湯水相提取物，至于白頭翁其他溶液相的作用如何，比如正丁醇、乙醚等有機(jī)相的作用和效果如何，是否比水相具有更好的效果，尚需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

4 結(jié)論

本研究表明，白頭翁湯水相提取物對(duì)痢疾桿菌有一定程度的抑菌和殺菌作用，白頭翁湯水相提取物可能破壞痢疾桿菌的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，從而抑制痢疾桿菌生長(zhǎng)，其抑菌作用隨著水相提取物濃度的增加、以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。即白頭翁湯水相提取物對(duì)痢疾桿菌的抑制作用有著濃度和時(shí)間依賴(lài)性。白頭翁湯也可通過(guò)降低痢疾桿菌DNA含量而達(dá)到抑菌作用。另一方面，白頭翁湯水相提取物還可通過(guò)影響呼吸作用的關(guān)鍵酶比如蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)和琥珀酸脫氫酶(SDH)來(lái)調(diào)控痢疾桿菌的生存或者死亡。