石全紅，詹 傲，崔榮周，王 佳 (.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，重慶40006;.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶4033)

livin 是凋亡抑制蛋白，livin 基因包括 livinα、livinβ 2 種亞型，有研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)細(xì)胞瘤中l(wèi)ivinβ mRNA 表達(dá)高于正常對照組。livinα、livinβ 2 亞型，分別編碼298 個(gè)氨基酸和280 個(gè)氨基酸的不同亞型結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。本研究采用RNA 干擾技術(shù)，構(gòu)建了針對人livinβ基因的特異性短發(fā)卡RNA(siRNA)真核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞，并觀察其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞livinβ基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

人星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U251)購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué));pGenesil-11 購于武漢晶賽公司，Tris 購于美國Promega公司，PVDF膜購于MILLIPORE，預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購于Fermentas 公司，Rabbit anti-human livin 抗體購于武漢博士德，Rabbit anti-GAPDH 多克隆抗體購于武漢晶賽公司，動(dòng)物RNAout(Trizol RNA 提取試劑用于細(xì)胞RNA 的提取)天澤基因工程有限公司產(chǎn)品;ReverTra Ace-α-TM-RT-PCR Kit 用于以RNA 為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一條鏈，購自東洋紡(上海)生物科技有限公司;PCR 引物購于武漢博潔公司;DNA marker DL2000(TaKaRa)購于武漢亞法公司產(chǎn)品;Taq DNA 聚合酶購于MBI 公司，總RNA 提取試劑盒購于上海華舜公司，TaKaRa RNA PCR Kit 購于 TaKaRa 生物有限公司，DNA marker DL2000、DNA marker 均購于TaKaRa 生物有限公司，Gold View Nucleic Acid Stain 購于北京賽百盛基因技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建策略 pGenesil-11 是一種新型的真核表達(dá)載體，其以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent，EGFP)為報(bào)告基因，并同時(shí)表達(dá)2 條shRNA。采用PCR 方法合成2 條shRNA，用XcmⅠ限制性內(nèi)切酶將pGenesil-11 酶切成線性質(zhì)粒，用Ligation mixture 連接酶將2 條 shRNA 與線性質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α，篩選陽性轉(zhuǎn)化的DH5α，并應(yīng)用酶切和基因測序鑒定質(zhì)粒。構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名pGenesil-11-livinβ-siRNA，見圖1。

圖1 同時(shí)表達(dá)2 條shRNA 和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的重組質(zhì)粒

1.2.2 livinβ-siRNA 序列設(shè)計(jì)及合成 目的基因針對 livinβ基因序列設(shè)計(jì):干擾序列 livinβ1 GGAAGAGACTTTGTCCACA，livinβ2 CCGTGTCCATCGTCTTTGT。設(shè)計(jì)并合成 PCR-F 引物BIRC71 和 PCR-R 引物 BIRC72:livinβ1 GGAAGAGACTTTGTCC ACA，livinβ1-F 5’CAAAAAGGAAGAGACTTTGTCCACATTCGTG TGGACAAAGTCTCTTCCGGTGTTTCGTC-3’，livinβ2 CCGTGTCC ATCGTCTTTGT，livinβ2-R 5’GAAAAACCGTGTCCATCGTCTTTG TTCTCACAAGACGATGGACACGGCGGGAAAGAGTG-3’。 分 別以 PCR-F 引物 livinβ1 和 PCR-R 引物 livinβ2 為上、下游引物，以質(zhì)粒pENTR/K4-Shsample 為模板，體外35 ℃→45 ℃梯度1℃ 1 個(gè)循環(huán)，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 個(gè)循環(huán) PCR 擴(kuò)增 livinβ1+livinβ2 片段。1%Agarose 凝膠電泳回收 siRNA(圖2)。經(jīng)XcmⅠ酶切反應(yīng)體系，凝膠電泳回收質(zhì)粒pGenesil-11 XcmⅠ酶切大片段酶切分析(圖3)。

圖2 PCR 擴(kuò)增獲得的siRNA

圖3 質(zhì)粒pGenesil-11 XcmⅠ酶切分析

1.2.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 制備E.coli DH5α 感受態(tài)菌，進(jìn)行連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:取10 mL 過夜連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，涂布于含Kanar 的LB 平板上，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)過夜，挑取3 個(gè)單菌落分別接種于5 mL 含Kanar 的LB 培養(yǎng)液中，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)過夜。

1.2.4 重組質(zhì)粒的抽提及鑒定 重組質(zhì)粒抽提后，進(jìn)行DNA 序列測定(由上海英駿公司完成)。將陽性菌株接種于含有 Kana(50 μg/mL)的 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 搖菌過夜，取1 mL 菌液移入滅菌的1.5 mL 離心管中，加入0.25 mL 100%滅菌甘油，混勻后-80 ℃保存重組質(zhì)粒備用。

1.3 重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)分析

1.3.1 人星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 的培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液，傳代培養(yǎng)后，制成單細(xì)胞懸液，顯微鏡下，用10 倍物鏡觀察計(jì)數(shù)板4 個(gè)象限中4 個(gè)大方格中的細(xì)胞數(shù)，代入公式:細(xì)胞懸液的濃度(個(gè)/毫升)=(4 大方格細(xì)胞數(shù)之和/2)×104計(jì)數(shù)。

1.3.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 按照Lipofectamine 2000 說明書配制轉(zhuǎn)染液。人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 的轉(zhuǎn)染:將細(xì)胞分為3 組，Ⅰ組為轉(zhuǎn)染組，即轉(zhuǎn)染液中含重組質(zhì)粒;Ⅱ組為空載體組，即轉(zhuǎn)染液中僅含pGenesil-11 質(zhì)粒;Ⅲ組為對照組，即轉(zhuǎn)染液中不含有質(zhì)粒。細(xì)胞接種24 h 后，在24 孔板每孔中分別加入100 μl 轉(zhuǎn)染液，置于37 ℃，含5%CO2的恒溫孵箱內(nèi)培養(yǎng)8 h 后，更換為含雙抗的1640 +10%FBS 完全培養(yǎng)基，24 ～48 h 在熒光倒置顯微鏡下觀察重組質(zhì)粒在細(xì)胞中的表達(dá)。一個(gè)視野下數(shù)100 個(gè)細(xì)胞，數(shù)3 次取平均值。

1.3.3 RT-PCR 檢測重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 U251 后 livinβ 基因的表達(dá)RT-PCR 反應(yīng)條件95 ℃ 5 min 1 個(gè)循環(huán);95 ℃ 20 s;60 ℃20 s;72 ℃ 10 s;共35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延長3 min 后結(jié)束擴(kuò)增。按5︰1 比例，取 5 μl PCR 產(chǎn)物與 1 μl 緩沖液混合進(jìn)行 2% 的瓊脂糖凝膠電泳，100 V 35 min，電泳結(jié)束后，凝膠成像掃描儀分析，采用Quantity One 軟件分析系統(tǒng)，對重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 U251 后livinβ 基因產(chǎn)物進(jìn)行光密度值分析。

1.3.4 Western blot 檢測重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 U251 后 livin 蛋白每106個(gè)細(xì)胞加入1 mL RIPA 蛋白提取液，收集裂解的細(xì)胞，轉(zhuǎn)膜，封閉，稀釋一抗，抗人 livin(1︰200)，內(nèi)參兔抗 - GAPDH(1︰10 000)，稀釋二抗羊抗兔 IgG/HRP，稀釋比例均為 1︰2 500，按 0.2 mL/cm2分別加入二抗，PVDF 膜曝光成像，用Quantity One 軟件分析蛋白區(qū)帶，將livin 光密度值與內(nèi)參GAPDH 光密度值相比，為livin 相對光密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0 統(tǒng)計(jì)軟件，所有計(jì)量資料均采用方差分析，P ＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ雙酶切后，電泳結(jié)果顯示，能夠被Nde I酶切出一條約447 bp DNA 小帶的質(zhì)粒即為克隆成功的質(zhì)粒，第3、5 泳道分別有一條與我們預(yù)期結(jié)果相符合的明亮條帶，見圖4。

圖4 重組質(zhì)粒插入片段的限制性酶切分析

2.2 重組質(zhì)粒的序列測定

重組質(zhì)粒測序結(jié)果及質(zhì)譜分析見圖5，經(jīng)BLAST 查詢確定其分別為特異性序列。TTATGTaaCGCGGaaCTCCATATATGGGC TATGAACTAATGACCCCGTAATTGATTACTATTAATAACTACGC GTGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGT TTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGGAAAAACCG TGTCCATCGTCTTTGTTCTCACAAAGACGATGGACACGGCGGG AAAGAGTGATCTCATACAGAACTTATAAGATTCCCAAATCCAA AGACATTTCACGTTTATGATGATTTCCCAGAACACATAGCGAC ATGCAAATATTGCAGGGCGCCACTCCCCTGTCCCTCACAGCCA TCTTCCTGCCAGGGCGCACGCGCGCTGGGTGTTCCCGCCTGGT GACACTGGGCCCGCGATTCCTTGGAGCGGGTTGATGACGTCA GCGTTCAGATCGATCCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATT TCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTT AGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACGAAGATA TTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGG TAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGCTTTAAAATGGACTATCATA TGCCTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATAT ATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGAAGAGACTTTGTCCAC ACGAATGTGGACAAAGTCTCTTCCTTTTTGATGATTTCCCAGA ACACATAGCGACATGCAAATATTGCAGGGCGCCACTCCCCTG TCCCTCACAGCCATCTTCCTGCCAGGGCGCACGCGCGCTGGGT GTTCCCGCCTGGTGACACTGGGCCCGCGATTCCTTGGAGCGGG TTGATGACGTCAGCGTTCAGATCGATCCAATGTCGGGCAGGAA GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATT ACAAGGCTGTTAGAGAGA。

圖5 重組質(zhì)粒pGenesil-11-livinβ-siRNA 的測序圖譜

2.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染結(jié)果

轉(zhuǎn)染24 ～48 h 熒光顯微鏡下觀察，在對照組中未發(fā)現(xiàn)表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染組和空載體組均可發(fā)現(xiàn)大量表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞，見圖6。熒光顯微鏡下一個(gè)視野下數(shù)100 個(gè)細(xì)胞，數(shù)3 次取平均值(59 +63 +60)/3 =60.7，照相確定轉(zhuǎn)染效率約為60.7%。轉(zhuǎn)染后48 ～72 h 為熒光表達(dá)的高峰期，一周后熒光表達(dá)開始減弱，至3 周時(shí)仍可觀察到表達(dá)綠色熒光的個(gè)別細(xì)胞。

圖6 轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 鏡下觀察(×200)

2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 livinβ mRNA 的表達(dá)

RT-PCR 檢測重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 后，細(xì)胞中l(wèi)ivinβ mRNA 的表達(dá)，見圖7。采用隨機(jī)區(qū)組方差分析顯示，3組之間表達(dá)差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 525.6，P ＜0.05)，且轉(zhuǎn)染組分別與空載體組、正常對照組有顯著差異(P ＜0.05)，而空載體組、正常對照組之間無差異(P ＞0.05)，見表1。

2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 livin 蛋白的表達(dá)

Western blot 檢測重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 后，細(xì)胞中l(wèi)ivin 蛋白的表達(dá)，結(jié)果見圖8。采用隨機(jī)區(qū)組方差分析顯示，3組之間表達(dá)差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=300.8，P ＜0.05)，且轉(zhuǎn)染組分別與空載體組、正常對照組有顯著差異(P ＜0.05)，而空載體組、正常對照組之間無差異(P ＞0.05)，見表2。

圖7 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 后，細(xì)胞中l(wèi)ivinβ mRNA 的表達(dá)

表1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 livinβ mRNA 的表達(dá)

圖8 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 livin 蛋白表達(dá)

表2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 livin 蛋白的表達(dá)

3 討論

抑制基因表達(dá)目前多傾向于使用RNA 干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)，是應(yīng)用 21 ～23 個(gè)堿基大小的小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)在體內(nèi)高效、特異地阻斷或者降低同源基因的表達(dá)，促使同源mRNA 降解，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，從而抑制基因的表達(dá)，或者說是引發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。

由于siRNA 可以在不影響非特異性干擾素途徑的情況下抑制靶基因的表達(dá)，具有選擇余地大和擴(kuò)增放大效應(yīng)，只需微量特異的siRNA 即可產(chǎn)生明顯的抑制基因表達(dá)效果。但是siRNA 進(jìn)入細(xì)胞后容易被降解，24 h 后阻抑效果降低，其作用時(shí)間僅持續(xù)約72 h，因此作用時(shí)間短暫是其致命缺陷。為克服此缺陷，人們設(shè)想利用載體介導(dǎo)siRNA 體內(nèi)表達(dá)技術(shù)。其原理是將siRNA 對應(yīng)的DNA 模板插入載體，位于RNA 聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子下游，在RNA 聚合酶Ⅲ作用下轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生含發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的siRNA，即shRNA［1］。設(shè)計(jì)針對靶基因的siRNA 模版DNA，將其與質(zhì)粒連接后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，DNA 模版在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成的shRNA 具有與siRNA同樣的抑制靶基因表達(dá)的作用，這種作用可持續(xù)數(shù)月之久［2］，并且可以突破細(xì)胞界限，在不同細(xì)胞間長距離傳遞和維持，并可傳遞給子代。

目前國內(nèi)外制備siRNA 的方法有很多種，包括化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄、PCR 合成、構(gòu)建 shRNA 表達(dá)載體等［3］。PCR 合成可以快速篩選到有效的的 siRNA，而且由于PCR 產(chǎn)物表達(dá)框末端并限制性位點(diǎn)，使其更容易被克隆到質(zhì)?；虿《据d體中，形成PCR 產(chǎn)物表達(dá)框表達(dá)載體［4］。本研究通過 PCR 方法成功獲得了livinβ-siRNA，并發(fā)揮了抑制 livinβ 基因表達(dá)的作用。與其他方法相比，用PCR 方法獲得siRNA 速度快，適用于快速篩選、研究特定基因，花費(fèi)比較少，能有效抑制目的基因表達(dá)［5］。

本實(shí)驗(yàn)所用載體為pGenesil-11 線性化質(zhì)粒。該質(zhì)粒具有綠色熒光蛋白(GFP)報(bào)告基因。與普遍使用的酶類報(bào)告基因不同，GFP 具有以下優(yōu)點(diǎn):①易于檢測，不需加任何底物，只需紫外線或藍(lán)光激發(fā)即可發(fā)出綠色熒光。②相對分子量小，編碼GFP 的基因序列約2.6 kb，便于載體構(gòu)建，不至于由于質(zhì)粒過大影響轉(zhuǎn)化率。③大量表達(dá)對細(xì)胞無毒性。④將含有GFP 與目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下可直接觀察轉(zhuǎn)染是否成功及轉(zhuǎn)染效率。⑤可以作為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植后在體內(nèi)的示蹤劑，這將便于我們研究轉(zhuǎn)染基因細(xì)胞在體內(nèi)存活和分化情況。隨著人們對GFP 研究的深入，已經(jīng)得到了許多GFP 的突變型，如本實(shí)驗(yàn)中采用的載體-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)，其熒光強(qiáng)度是GFP 的35 倍，而且在激發(fā)16 ～24 h 后仍可穩(wěn)定表達(dá)熒光［6］。

因此，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的livinβ-siRNA 表達(dá)載體pGenesil-11-livinβ-siRNA，可允許目的基因與報(bào)告基因(EGFP)同時(shí)以相同水平表達(dá)。直接可以在熒光顯微鏡下觀察表達(dá)載體轉(zhuǎn)染是否成功及轉(zhuǎn)染效率，得出本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率約為60.7%。并且經(jīng)酶切、測序鑒定證實(shí)本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了livinβ-siRNA 表達(dá)載體pGenesil-11-livinβ-siRNA，并在真核細(xì)胞即人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中能正常表達(dá)。應(yīng)用RT-PCR、Western blot 等實(shí)驗(yàn)證實(shí)pGenesil-11-livinβ 轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 后，可以在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平抑制livinβ 基因和蛋白表達(dá)。

［1］Sui G，Soohoo C，Affar elB，et a1.A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mamalian cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(8):55l5 -5520.

［2］Brummelkamp TR，Bernards R，Agami R.A system for stable expressionof short interfering RNAs in mamalian cells［J］.Science，2002，296(5567):550 -553.

［3］Banan M，Puri N.The ins and outs of RNAi in mammalian cells［J］.Curr Pharm Biotechnol，2004，5(5):441 -450.

［4］洪 權(quán)，吳 鏑，陳香美，等.利用PCR 方法獲得shRNA 抑制內(nèi)外源性基因的表達(dá)［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2005，30(9):800 -803.

［5］Castanotto D，Soberer L.Targeting cellular genes with PCR cassettes expressing short interfering RNAs［J］.Methods Enzymol，2005，392:173-185.

［6］Yang TT，Sinai P，Green G，et al.Improved fluorescence and dual color detection with enhanced blue and green variants of the green fluorescent protein［J］.J Biol Chem，1998，273(14):8212 -8217.