蔡其燕，姚忠祥 (第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部:.組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室;.生理學(xué)教研室，重慶400038)

腦白質(zhì)損傷常與神經(jīng)退行性疾病伴發(fā)，但其發(fā)病機制目前尚未得到完全闡明。近來研究發(fā)現(xiàn)慢性腦缺血可導(dǎo)致腦白質(zhì)出現(xiàn)廣泛的少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡、髓鞘脫失、軸突損傷等病理改變［1-2］。因此尋找有效的藥物治療慢性腦缺血將有助于延緩腦白質(zhì)損傷及神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。梓醇是一種環(huán)烯醚萜葡萄糖苷類化合物，主要存在于地黃等植物中。研究發(fā)現(xiàn)梓醇可抑制缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡［3-4］。但其對少突膠質(zhì)細(xì)胞的保護作用，尚屬未知。最近研究報道梓醇可通過Akt 通路抑制H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［5］，這提示梓醇的保護作用可能與Akt 通路的激活有關(guān)。本研究通過永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈建立慢性腦缺血模型，檢測梓醇對腦白質(zhì)的保護作用及其與Akt 通路的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 動物分組

18 只成年雄性 Wistar 大鼠，體質(zhì)量 250 ～300 g，購于第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心。將大鼠隨機分為假手術(shù)組(Sha 組)，生理鹽水處理組(Veh 組)和梓醇處理組(Cat組)，每組 6 只。

1.2 大鼠慢性腦缺血模型制備和給藥方法

大鼠術(shù)前禁食12 h、禁水4 h。腹腔注射1%戊巴比妥鈉進行麻醉，采用頸部正中切口，暴露雙側(cè)頸總動脈，用雙重絲線分別在近心端和遠(yuǎn)心端進行結(jié)扎，在結(jié)扎兩端中間剪斷。術(shù)中控制溫度在36.5 ～37.5 ℃。Sha 組不結(jié)扎和剪斷頸總動脈，其余步驟和模型組相同。Veh 組和Cat 組大鼠分別于術(shù)后腹腔注射生理鹽水和梓醇(5 mg/kg)，每天1 次，連續(xù)10 d。

1.3 腦組織切片的制備

慢性腦缺血30 d 后，用1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，暴露心臟，用穿刺針插入右心室，同時剪開右心耳，生理鹽水灌注，至流出液體變清后，再灌注2.5%的Zamboni’s 固定液約300 mL。斷頭取腦，置于Zamboni’s 液中固定24 h。腦組織塊用30%蔗糖液脫水至沉入瓶底。OCT 包埋，在有胼胝體區(qū)域連續(xù)冠狀冰凍切片，片厚20 μm。

1.4 盧卡斯快藍染色

腦片經(jīng)0.01 mol/L PBS 充分漂洗后裱片于鉻釩明膠包被的載玻片上，37 ℃烤片2 h;置于1% 盧卡斯快藍(luxol fast blue，LFB)染液中染色8 h(60 ℃);95%酒精洗去多于染液，轉(zhuǎn)入蒸餾水中充分漂洗;0.05%碳酸鋰溶液分色20 s，蒸餾水漂洗;70%酒精繼續(xù)分色至灰質(zhì)和白質(zhì)能明顯區(qū)分;自來水沖洗后，用梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測

1.5.1 免疫酶標(biāo)染色 腦片經(jīng) 0.01 mol/L PBS 充分漂洗后，用3%雙氧水于室溫處理15 min，PBS 漂洗3 次(每次5 min)，用5%BSA 于37 ℃作用30 min 封閉抗體的非特異性結(jié)合。加一抗(APC 小鼠單克隆抗體，1 ∶100，Calbiochem 公司;MBP 山羊多克隆抗體，1∶200，Santa Cruz 公司;p-Akt 兔多克隆抗體，1∶100，Cell signaling 公司)，4 ℃ 過夜。生物素標(biāo)記二抗(1∶100)，37 ℃ 孵育 2 h，PBS 漂洗 3 次。SABC 復(fù)合物(Vector公司)，37 ℃孵育 1 h，DAB 顯色后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并照相。以0.01 mol/L PBS代替一抗作為陰性對照。用Image-Plus Pro 5.0 軟件計算免疫陽性光密度值和免疫陽性細(xì)胞數(shù)。

1.5.2 免疫熒光雙標(biāo)染色 腦片經(jīng)PBS 充分漂洗后，用5%BSA 于37 ℃作用30 min 封閉抗體的非特異性結(jié)合。切片同時加入 APC(1∶100)和 caspase-3(1∶100)抗體，或 APC(1∶100)和p-Akt(1∶100)抗體，37 ℃孵育 2 h 后，于 4 ℃孵育過夜。PBS 漂洗3 次后，同時加入Cy3 標(biāo)記的兔抗小鼠和FITC 標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗(1∶100，Abcam 公司)，37 ℃ 避光孵育 3 h，PBS 漂洗，用水溶性封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并照相。Image-Plus Pro 5.0 軟件計算雙陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 梓醇抑制腦白質(zhì)少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示(圖1a、b、c、g)Sha 組胼胝體內(nèi)APC 陽性的少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)較多，Veh 組的少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)與Sha 組比較明顯減少(P ＜0.01)。梓醇治療后，Cat 組胼胝體的少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)明顯增多，與Veh 組比較，具有顯著性差異(P ＜0.05)。APC 與 caspase-3 免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示(圖1d、e、f、h)Sha 組胼胝體內(nèi)雙陽性的凋亡少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)較少，Veh 組雙陽性的凋亡細(xì)胞數(shù)與 Sha 組比較明顯增多(P ＜0.01)。梓醇治療后，凋亡的少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)明顯降低，與Veh 組比較，有顯著性差異(P ＜0.05)。

圖1 免疫組織化學(xué)染色顯示梓醇對慢性腦缺血大鼠胼胝體少突膠質(zhì)細(xì)胞的影響

2.2 梓醇緩解腦白質(zhì)髓鞘損傷

LFB 髓鞘染色和MBP 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見圖2。在Sha 組中，LFB 染色和MBP 染色深、邊界清晰明顯。腦缺血損傷后，髓鞘稀疏，LFB 和MBP 染色變淺，兩者的平均光密度值顯著下降(與 Sha 組比較，P ＜0.01)。梓醇治療后，LFB 和 MBP 染 色的平均光密度值明顯升高(與 Veh 組比較，P ＜0.05)。

圖2 LFB 和免疫組織化學(xué)染色顯示梓醇對慢性腦缺血大鼠胼胝體髓鞘的影響

2.3 梓醇上調(diào)腦白質(zhì)p-Akt 表達

p-Akt 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見圖3。在Sha 組胼胝體中，p-Akt 陽性細(xì)胞數(shù)較少。缺血損傷后，p-Akt 陽性細(xì)胞數(shù)有少量增加，但與Sha 組比較無明顯差異。梓醇治療后，p-Akt 陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，與Veh 組比較，差異顯著(P ＜0.01)。免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果進一步顯示梓醇可明顯增加胼胝體APC 和p-Akt雙陽性細(xì)胞數(shù)，即梓醇促進p-Akt 在少突膠質(zhì)細(xì)胞的表達(與Veh 組比較，P ＜0.01)。

圖3 免疫組織化學(xué)染色顯示梓醇對慢性腦缺血大鼠胼胝體p-Akt 表達的影響

3 討論

人類腦白質(zhì)約占全腦組織的50%，輕度缺血即可造成腦白質(zhì)損傷［6］。胼胝體作為腦白質(zhì)的易損區(qū)域之一，在缺血后可通過損傷的神經(jīng)纖維破壞白質(zhì)與灰質(zhì)之間的信號傳遞，造成全腦性的神經(jīng)功能障礙［7］。在慢性腦缺血中，腦白質(zhì)可由于少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡、髓鞘脫失及神經(jīng)纖維斷裂，最終導(dǎo)致腦白質(zhì)的疏松和空泡樣病變［8］。少突膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成細(xì)胞，對體內(nèi)外缺血損傷極其敏感，慢性、輕微、持續(xù)性腦缺血時少突膠質(zhì)細(xì)胞較神經(jīng)元更易受損［9］。少突膠質(zhì)細(xì)胞受損或凋亡則可造成髓鞘的損傷，最終影響神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)。因此，少突膠質(zhì)細(xì)胞損害作為缺血時腦白質(zhì)損傷的重要原因，正在受到更多的關(guān)注［10］。在本研究中，利用APC 和MBP 免疫組織化學(xué)染色及LFB 染色法檢測腦白質(zhì)的損傷情況，發(fā)現(xiàn)慢性腦缺血可誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和髓鞘損傷，梓醇治療后則可明顯抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和髓鞘損傷，這說明梓醇對腦白質(zhì)的保護作用與其抗凋亡效應(yīng)有關(guān)。

caspase-3 是細(xì)胞凋亡過程中最重要的一種半胱氨酸蛋白酶，受凋亡刺激因素作用后被激活，活化的caspase-3 可通過裂解其底物，直接激活其他的蛋白酶如caspase-2 和caspase-9，或誘導(dǎo)線粒體功能障礙等多條途徑促進細(xì)胞凋亡［11］。研究發(fā)現(xiàn)通過腦室內(nèi)注射caspase-3 抑制劑可獲得對缺血性腦損傷的保護作用［12］，這說明 caspase-3 的激活與腦缺血損 傷有關(guān)［13-14］。Walker 等［15］研究發(fā)現(xiàn)缺血缺氧可誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)caspase-3 的激活，參與少突膠質(zhì)細(xì)胞的缺血性損傷。Han 等［12］也報道了 caspase-3 激活對少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，抑制caspase-3 活性可促進少突膠質(zhì)細(xì)胞的存活。本研究結(jié)果顯示梓醇可明顯抑制慢性腦缺血誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)caspase-3 表達的增多，這提示梓醇可通過降低caspase-3 的活性來抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。

絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt 被磷酯酰肌醇3 激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)磷酸化激活后，可通過不同途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活和凋亡?；罨腁kt(即p-Akt)一方面通過磷酸化一系列凋亡調(diào)控蛋白，如Bad、caspase-3 等，使這些促凋亡蛋白失活;另一方面通過促進抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄和表達，來促進細(xì)胞的存活，如p-Akt 使CREB 磷酸化后，激活 CREB 的轉(zhuǎn)錄功能，使Bcl-2、Bcl-xL 表達增強，穩(wěn)定線粒體的功能狀態(tài)，促進細(xì)胞存活［16］。在腦缺血損傷中，p-Akt 除了對神經(jīng)元具有廣泛的保護作用外，對于少突膠質(zhì)細(xì)胞的存活也具有重要的調(diào)節(jié)作用，如Pang 等［17］發(fā)現(xiàn)p-Akt可明顯抑制TNF-α 介導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷，促進少突膠質(zhì)細(xì)胞存活。本實驗結(jié)果顯示，梓醇治療可明顯提高p-Akt 在少突膠質(zhì)細(xì)胞的表達，抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡。這提示梓醇在慢性腦缺血中對少突膠質(zhì)細(xì)胞的保護作用可能與Akt 通路的激活有關(guān)。

綜上所述，梓醇可明顯抑制慢性腦缺血誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和髓鞘損傷，梓醇對腦白質(zhì)的保護作用與其上調(diào)p-Akt 的表達相關(guān)。本研究結(jié)果為臨床治療腦缺血損傷提供了新的研究思路和候選藥物。

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