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隨著人口老齡化以及不良生活方式的影響，糖尿病的發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì)。糖尿病是一種以胰島素分泌不足或抵抗為特征的代謝障礙性疾病，如何提高胰島素的分泌和減輕胰島素抵抗是治療糖尿病的關(guān)鍵。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，梓醇可以降低糖尿病大鼠空腹血糖水平，增加胰島素敏感性，保護(hù)胰島細(xì)胞[1]。本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步探討梓醇對(duì)糖尿病大鼠胰島細(xì)胞Insulin表達(dá)的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 健康雄性Wistar大鼠共100只，8周齡，購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。高糖高脂飼料配方參照徐叔云《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[2]，購(gòu)自哈爾濱市博士德試劑公司。

1.2 主要試劑及儀器 梓醇、鏈脲佐菌素、Insulin antibody、Anti-phospho-腺苷酸活化蛋白激酶-α1(AMPK-α1)、離心機(jī)、組織包埋機(jī)、分析天平、石蠟切片機(jī)、磁力攪拌器、奧林巴斯顯微攝像系統(tǒng)。

1.3 動(dòng)物分組及干預(yù)方法 參照前期實(shí)驗(yàn)[1]：選取雄性Wistar大鼠，8周齡，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組(10只)與實(shí)驗(yàn)組(90只)。實(shí)驗(yàn)組飼養(yǎng)8周高糖高脂飲食后經(jīng)腹腔注射鏈脲佐菌素，劑量為15 mg/kg，以空腹血糖≥16.7 mmol/L作為2型糖尿病成模標(biāo)準(zhǔn)，將符合2型糖尿病成模標(biāo)準(zhǔn)的60只大鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組、梓醇低劑量組、梓醇中劑量組、梓醇高劑量組。正常組和模型組灌胃蒸餾水5 mL/(kg·d)；二甲雙胍組灌胃二甲雙胍90 mg/(kg·d)；梓醇低、中、高劑量組分別灌胃梓醇2.5 mg/(kg·d)、5 mg/(kg·d)、10 mg/(kg·d)。分別干預(yù)12周后，經(jīng)免疫組化檢測(cè)胰島細(xì)胞Insulin的表達(dá)水平，Western Blot 檢測(cè)AMPK-α1蛋白表達(dá)。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胰島細(xì)胞Insulin的表達(dá) 用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胰島細(xì)胞中Insulin的表達(dá)。3%H2O2孵育，EDTA微波修復(fù)抗原，滴加一抗，37 ℃孵育1 h，4 ℃冰箱過(guò)夜，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗，選用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水透明，樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，光鏡下所見(jiàn)黃褐色顆粒為陽(yáng)性，應(yīng)用HPIAS-1000型全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)，每組隨機(jī)選取5張切片，測(cè)定陽(yáng)性染色積分光密度值(integral optical density，IOD)，取其平均值作為該標(biāo)本的IOD值。

1.5 Western Blot檢測(cè)AMPK-α1蛋白表達(dá)水平 分離胰島取5 mg組織，放入裂解液中裂解，在冰浴下勻漿，以4 ℃離心(10 000 r/min，10 min)，取上清液用酚試劑法測(cè)定各組蛋白濃度后，制成蛋白濃度相等的樣品，取20 μL蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，之后電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，用3%牛血清白蛋白(BSA)封閉2 h，分別滴加兔抗鼠AMPK-α1抗體，于4 ℃下孵育過(guò)夜，洗膜后選擇相應(yīng)堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，應(yīng)用堿性磷酸酶顯色，并在凝膠自動(dòng)成像分析系統(tǒng)下成像。以AMPK-α1蛋白表達(dá)作為觀測(cè)指標(biāo)。

2 結(jié) 果

2.1 各組Insulin表達(dá)比較 干預(yù)12周后免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組、二甲雙胍組、梓醇低劑量組、梓醇中劑量組、梓醇高劑量組大鼠胰島細(xì)胞Insulin均表達(dá)減少。與模型組比較，二甲雙胍組、梓醇低劑量組、梓醇中劑量組、梓醇高劑量組大鼠胰島細(xì)胞Insulin表達(dá)增多，其中梓醇高劑量組、梓醇低劑量組Insulin表達(dá)與二甲雙胍組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。詳見(jiàn)圖1、圖2。

A為正常組；B為模型組；C為二甲雙胍組；D為梓醇高劑量組；E為梓醇中劑量組；F為梓醇低劑量組。與正常組比較，#P< 0.01；與模型組比較，＊P< 0.01；與二甲雙胍組比較，△P< 0.01。

圖2各組Insulin表達(dá)灰度值比較

2.2 各組AMPK-α1蛋白表達(dá)比較 干預(yù)12周后Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組比較，其他各組胰島細(xì)胞AMPK-α1蛋白表達(dá)均減少(P< 0.01)；與模型組比較，二甲雙胍組、梓醇低劑量組、梓醇中劑量組、梓醇高劑量組胰島細(xì)胞AMPK-α1蛋白表達(dá)增多(P< 0.01)，其中梓醇高劑量組AMPK-α1蛋白表達(dá)較二甲雙胍組、梓醇低劑量組、梓醇中劑量組表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。詳見(jiàn)圖3。

A為正常組；B為模型組；C為二甲雙胍組；D為梓醇低劑量組；E為梓醇中劑量組；F為梓醇高劑量組。與正常組比較，#P< 0.01；與模型組比較，＊P< 0.01；與梓醇高劑量組比較，△P< 0.01。

圖3各組AMPK-α1蛋白表達(dá)的表達(dá)

3 討 論

糖尿病的主要病理基礎(chǔ)是胰島素分泌不足和(或)胰島素抵抗[3]。持續(xù)高血糖可導(dǎo)致心、腦、腎、眼底等多種靶器官損害[4-5]。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)梓醇可以降低糖尿病大鼠血糖，增加胰島素分泌指數(shù)，HE染色結(jié)果亦提示梓醇可保護(hù)胰島B細(xì)胞[1]。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察Insulin分泌水平，模型組大鼠胰島細(xì)胞呈淡黃色，而梓醇各劑量組胰島細(xì)胞胞漿呈橙黃色，經(jīng)灰度值統(tǒng)計(jì)結(jié)果證實(shí)，梓醇各劑量組胰島B細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，Insulin表達(dá)水平明顯高于模型組。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是一種能量調(diào)控器，由功能亞基(α)和調(diào)節(jié)亞基(β，γ)構(gòu)成的異源三聚體，AMPK 參與了體內(nèi)葡萄糖的代謝調(diào)節(jié)，因此，AMPK 是糖尿病病人代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一[6]。激活A(yù)MPK 能夠促進(jìn)葡萄糖的攝取、糖酵解、脂肪酸氧化并且抑制糖原合成、改善胰島素抵抗[7-8]。AMPK分多種亞型，其中起主要作用的是AMPK-α1。為探討梓醇增加胰島素分泌、減輕胰島素抵抗、降低血糖的機(jī)制，本研究應(yīng)用Western Blot方法檢測(cè)胰島素細(xì)胞AMPK-α1蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與其他各組比較，梓醇高劑量組AMPK-α1蛋白表達(dá)明顯增多，從而說(shuō)明梓醇是通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK-α1蛋白的表達(dá)以促進(jìn)胰島細(xì)胞分泌胰島素，從而發(fā)揮降低血糖的作用。

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