,,, , ,
隨著人口老齡化以及不良生活方式的影響,糖尿病的發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì)。糖尿病是一種以胰島素分泌不足或抵抗為特征的代謝障礙性疾病,如何提高胰島素的分泌和減輕胰島素抵抗是治療糖尿病的關(guān)鍵。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí),梓醇可以降低糖尿病大鼠空腹血糖水平,增加胰島素敏感性,保護(hù)胰島細(xì)胞[1]。本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步探討梓醇對(duì)糖尿病大鼠胰島細(xì)胞Insulin表達(dá)的影響及作用機(jī)制。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 健康雄性Wistar大鼠共100只,8周齡,購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。高糖高脂飼料配方參照徐叔云《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[2],購(gòu)自哈爾濱市博士德試劑公司。
1.2 主要試劑及儀器 梓醇、鏈脲佐菌素、Insulin antibody、Anti-phospho-腺苷酸活化蛋白激酶-α1(AMPK-α1)、離心機(jī)、組織包埋機(jī)、分析天平、石蠟切片機(jī)、磁力攪拌器、奧林巴斯顯微攝像系統(tǒng)。
1.3 動(dòng)物分組及干預(yù)方法 參照前期實(shí)驗(yàn)[1]:選取雄性Wistar大鼠,8周齡,根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組(10只)與實(shí)驗(yàn)組(90只)。實(shí)驗(yàn)組飼養(yǎng)8周高糖高脂飲食后經(jīng)腹腔注射鏈脲佐菌素,劑量為15 mg/kg,以空腹血糖≥16.7 mmol/L作為2型糖尿病成模標(biāo)準(zhǔn),將符合2型糖尿病成模標(biāo)準(zhǔn)的60只大鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組、梓醇低劑量組、梓醇中劑量組、梓醇高劑量組。正常組和模型組灌胃蒸餾水5 mL/(kg·d);二甲雙胍組灌胃二甲雙胍90 mg/(kg·d);梓醇低、中、高劑量組分別灌胃梓醇2.5 mg/(kg·d)、5 mg/(kg·d)、10 mg/(kg·d)。分別干預(yù)12周后,經(jīng)免疫組化檢測(cè)胰島細(xì)胞Insulin的表達(dá)水平,Western Blot 檢測(cè)AMPK-α1蛋白表達(dá)。
1.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胰島細(xì)胞Insulin的表達(dá) 用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胰島細(xì)胞中Insulin的表達(dá)。3%H2O2孵育,EDTA微波修復(fù)抗原,滴加一抗,37 ℃孵育1 h,4 ℃冰箱過(guò)夜,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗,滴加二抗,37 ℃孵育30 min,PBS沖洗,選用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素復(fù)染,常規(guī)脫水透明,樹(shù)脂封片,顯微鏡下觀察。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照,光鏡下所見(jiàn)黃褐色顆粒為陽(yáng)性,應(yīng)用HPIAS-1000型全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng),每組隨機(jī)選取5張切片,測(cè)定陽(yáng)性染色積分光密度值(integral optical density,IOD),取其平均值作為該標(biāo)本的IOD值。
1.5 Western Blot檢測(cè)AMPK-α1蛋白表達(dá)水平 分離胰島取5 mg組織,放入裂解液中裂解,在冰浴下勻漿,以4 ℃離心(10 000 r/min,10 min),取上清液用酚試劑法測(cè)定各組蛋白濃度后,制成蛋白濃度相等的樣品,取20 μL蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,之后電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜,用3%牛血清白蛋白(BSA)封閉2 h,分別滴加兔抗鼠AMPK-α1抗體,于4 ℃下孵育過(guò)夜,洗膜后選擇相應(yīng)堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h,應(yīng)用堿性磷酸酶顯色,并在凝膠自動(dòng)成像分析系統(tǒng)下成像。以AMPK-α1蛋白表達(dá)作為觀測(cè)指標(biāo)。
2.1 各組Insulin表達(dá)比較 干預(yù)12周后免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組、二甲雙胍組、梓醇低劑量組、梓醇中劑量組、梓醇高劑量組大鼠胰島細(xì)胞Insulin均表達(dá)減少。與模型組比較,二甲雙胍組、梓醇低劑量組、梓醇中劑量組、梓醇高劑量組大鼠胰島細(xì)胞Insulin表達(dá)增多,其中梓醇高劑量組、梓醇低劑量組Insulin表達(dá)與二甲雙胍組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。詳見(jiàn)圖1、圖2。
A為正常組;B為模型組;C為二甲雙胍組;D為梓醇高劑量組;E為梓醇中劑量組;F為梓醇低劑量組。與正常組比較,#P< 0.01;與模型組比較,*P< 0.01;與二甲雙胍組比較,△P< 0.01。
圖2各組Insulin表達(dá)灰度值比較
2.2 各組AMPK-α1蛋白表達(dá)比較 干預(yù)12周后Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常組比較,其他各組胰島細(xì)胞AMPK-α1蛋白表達(dá)均減少(P< 0.01);與模型組比較,二甲雙胍組、梓醇低劑量組、梓醇中劑量組、梓醇高劑量組胰島細(xì)胞AMPK-α1蛋白表達(dá)增多(P< 0.01),其中梓醇高劑量組AMPK-α1蛋白表達(dá)較二甲雙胍組、梓醇低劑量組、梓醇中劑量組表達(dá)增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。詳見(jiàn)圖3。
A為正常組;B為模型組;C為二甲雙胍組;D為梓醇低劑量組;E為梓醇中劑量組;F為梓醇高劑量組。與正常組比較,#P< 0.01;與模型組比較,*P< 0.01;與梓醇高劑量組比較,△P< 0.01。
圖3各組AMPK-α1蛋白表達(dá)的表達(dá)
糖尿病的主要病理基礎(chǔ)是胰島素分泌不足和(或)胰島素抵抗[3]。持續(xù)高血糖可導(dǎo)致心、腦、腎、眼底等多種靶器官損害[4-5]。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)梓醇可以降低糖尿病大鼠血糖,增加胰島素分泌指數(shù),HE染色結(jié)果亦提示梓醇可保護(hù)胰島B細(xì)胞[1]。
本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察Insulin分泌水平,模型組大鼠胰島細(xì)胞呈淡黃色,而梓醇各劑量組胰島細(xì)胞胞漿呈橙黃色,經(jīng)灰度值統(tǒng)計(jì)結(jié)果證實(shí),梓醇各劑量組胰島B細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)完整,Insulin表達(dá)水平明顯高于模型組。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是一種能量調(diào)控器,由功能亞基(α)和調(diào)節(jié)亞基(β,γ)構(gòu)成的異源三聚體,AMPK 參與了體內(nèi)葡萄糖的代謝調(diào)節(jié),因此,AMPK 是糖尿病病人代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一[6]。激活A(yù)MPK 能夠促進(jìn)葡萄糖的攝取、糖酵解、脂肪酸氧化并且抑制糖原合成、改善胰島素抵抗[7-8]。AMPK分多種亞型,其中起主要作用的是AMPK-α1。為探討梓醇增加胰島素分泌、減輕胰島素抵抗、降低血糖的機(jī)制,本研究應(yīng)用Western Blot方法檢測(cè)胰島素細(xì)胞AMPK-α1蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,與其他各組比較,梓醇高劑量組AMPK-α1蛋白表達(dá)明顯增多,從而說(shuō)明梓醇是通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK-α1蛋白的表達(dá)以促進(jìn)胰島細(xì)胞分泌胰島素,從而發(fā)揮降低血糖的作用。
參考文獻(xiàn):
[1] 鄒國(guó)良,仲維莉,許瑞,等.梓醇對(duì)2型糖尿病大鼠胰島細(xì)胞的保護(hù)作用[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2016,15(14):1727-1729.
[2] 徐叔云,卞如濂.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:31-37.
[3] Huynh K,Bernardo BC,Mc Mullen JR,et al.Diabetic cardiomyopathy:mechanisms and new treatment strategies targeting antioxidantsignaling pathways[J].Pharmacol Ther,2014,142(3):375-415.
[4] 劉江月.梓醇對(duì)糖尿病大鼠主動(dòng)脈的保護(hù)作用與抗氧化機(jī)制研究[J].中國(guó)病理生理雜志,2014,30(6):1023-1028.
[5] Jiang B,Shen RF,Bi J,et al.Catalpol:a potential therapeutic for neurodegenerative diseases[J].Curr Med Chem,2015,22(10):1278-1291.
[6] Yang M,Zhang Z,Wang C,et al.Nesfatin-1 action in the brain increases insulin sensitivity through Akt/AMPK/TORC2 pathway in diet-induced insulin resistance [J].Diabetes,2012,61(8):1959-1968.
[7] Habegger KM,Hoffman NJ,Ridenour CM,et al.AMPK enhances insulin-stimuated GLUT4 regulation via lowering membrane cholesterol[J].Endocrinology,2012,153 (5):2130-2141.
[8] Han Y,Jung HW,Park YK.Effects of icariin on insulin resistance via the activation of AMPK pathway in C2C12 mouse muscle cells[J].Can J Cardiol,2015,31(4):502-508.