■余 岳王春維祝愛(ài)俠 李 濤

（1.武漢工業(yè)學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023；2.武漢市畜禽飼料工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430023）

乳酸菌是葡萄糖或乳糖在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的總稱，絕大多數(shù)乳酸菌能調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道功能紊亂和維系內(nèi)源微生態(tài)系統(tǒng)平衡，具有相當(dāng)重要的生理功能[1]。然而傳統(tǒng)的乳酸菌（如保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌等）不能生成芽孢，對(duì)高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及膽鹽的耐受性較差，經(jīng)制粒、膨化等加工過(guò)程制備成微生態(tài)飼料制劑并飼喂動(dòng)物后能到達(dá)腸道的活菌數(shù)相對(duì)較少。

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）屬于硬（或厚）壁菌門(mén)腸道乳酸菌，是一類(lèi)可產(chǎn)芽孢的特殊乳酸菌[2]。除了具有傳統(tǒng)乳酸菌可調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道健康、提高消化能力和提高免疫力等作用外，其芽孢狀態(tài)對(duì)環(huán)境具有相當(dāng)?shù)目鼓嫘裕瑢?duì)高溫、胃酸和膽鹽都有一定的耐受能力[3]。1992年該菌種被美國(guó)食品與藥物管理局（FDA）和美國(guó)飼料控制官員協(xié)會(huì)列入可用于飼料的安全菌株名單中[4]。芽孢體是凝結(jié)芽孢桿菌區(qū)別于傳統(tǒng)乳酸菌的關(guān)鍵所在，也是制備微生態(tài)飼料制劑的理想形態(tài)[5]。本試驗(yàn)旨在研究實(shí)驗(yàn)室保藏的一株凝結(jié)芽孢桿菌BCRC11592對(duì)高溫、強(qiáng)酸、膽鹽的耐受能力及其對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)抑制能力，并利用搖瓶液體發(fā)酵，優(yōu)化凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)孢率的培養(yǎng)條件，為微生態(tài)飼料制劑的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種：凝結(jié)芽孢桿菌BCRC11592為本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏。

種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，牛肉浸出粉3 g，氯化鈉5 g，水1 000 ml（固體培養(yǎng)基另添加15 g瓊脂）；調(diào)pH值為7.0，121℃滅菌20 min后冷卻至室溫。

發(fā)酵培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，牛肉浸出粉3 g，氯化鈉5 g，葡萄糖6.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，K2HPO42.0 g，MnSO4·H2O 50 mg，水 1 000 ml；調(diào) pH 值為7.0，121℃滅菌20 min后冷卻至室溫。

稀釋液：添加0.1%吐溫80的蒸餾水，121℃滅菌20 min后冷卻至室溫。

1.2 方法

1.2.1 活化菌株

將保存的菌株劃線接種到種子固體斜面培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.2 種子菌液制備

挑取純化培養(yǎng)的菌落于種子液體培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)液制備

將凝結(jié)芽孢桿菌種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

1.2.4 測(cè)定方法

①活菌數(shù)測(cè)定：以傾注法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)[6]。

②芽孢數(shù)測(cè)定：將培養(yǎng)菌液置于80℃水浴加熱10 min以充分滅活營(yíng)養(yǎng)體菌體細(xì)胞，再以傾注法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)[7]。

③產(chǎn)孢率公式

產(chǎn)孢率（%）=(芽孢數(shù)/活菌數(shù))×100

2 結(jié)果與分析

2.1 抗逆性及抑菌性能試驗(yàn)

2.1.1 溫度對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)和存活率的影響

參考顆粒飼料制備過(guò)程中調(diào)質(zhì)和造粒的具體時(shí)間和溫度[8]，設(shè)定試驗(yàn)溫度分別為60、70、80、90、100℃，試驗(yàn)時(shí)間均為10 min。吸取凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液100 μl于裝有900 μl無(wú)菌水的離心管中，在不同溫度下水浴加熱10 min后，適度稀釋?zhuān)瑴y(cè)定活菌數(shù)，以常溫下的發(fā)酵培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，計(jì)算凝結(jié)芽孢桿菌的存活率。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，下同。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 溫度對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)和存活率的影響

從圖1可以看出，該凝結(jié)芽孢桿菌具有優(yōu)秀的耐高溫能力，在90℃和100℃的高溫下處理10 min后存活率分別為81.9%和79.6%。

2.1.2 酸處理對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)和存活率的影響

根據(jù)動(dòng)物胃液pH值特點(diǎn)以及食糜在胃部停留時(shí)間，試驗(yàn)選取pH=2為耐受點(diǎn)，耐受時(shí)間分別為0.5、1、2、3和4 h[9]。吸取凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液100 μl于裝有900 μl、pH=2的稀釋液的離心管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)0.5、1、2、3和4 h后，適度稀釋?zhuān)瑴y(cè)定活菌數(shù)，以pH=7的稀釋液作為空白對(duì)照，計(jì)算凝結(jié)芽孢桿菌的存活率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酸處理對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)和存活率的影響

圖2結(jié)果表明，該凝結(jié)芽孢桿菌在pH=2.0的環(huán)境中保留4 h后的存活率仍超過(guò)了50%，具有優(yōu)秀的耐酸能力。

2.1.3 膽鹽對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)和存活率的影響

根據(jù)動(dòng)物腸道環(huán)境及食糜消化特點(diǎn)，試驗(yàn)選取膽鹽濃度0.3%為耐受點(diǎn)，耐受時(shí)間分別為1、2、4、6、8 h[10]。吸取凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液100 μl于裝有900 μl豬膽鹽濃度為0.3%的稀釋液的離心管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)1、2、4、6、8 h后，適度稀釋?zhuān)瑴y(cè)定活菌數(shù)，以未添加豬膽鹽的稀釋液作為空白對(duì)照，計(jì)算凝結(jié)芽孢桿菌的存活率，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 膽鹽對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)和存活率的影響

圖3結(jié)果表明，該凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)膽鹽的耐受能力很強(qiáng)，在0.3%的膽鹽環(huán)境中8 h后的存活率可達(dá)79.4%。

2.1.4 抑菌試驗(yàn)

采用大腸桿菌CCRC10306和金黃色葡萄球菌CCRC1780為指標(biāo)菌株進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。將指標(biāo)菌用種子培養(yǎng)基37℃恒溫培養(yǎng)36 h后，分別涂板、干燥，在培養(yǎng)基上打出直徑為8 mm的孔洞。然后將凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)3 000 r/min離心5 min后，吸取上清液100 μl注入孔洞內(nèi)，37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量其抑菌圈大小[12]。并與普通保加利亞乳桿菌對(duì)比抑菌能力，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 抑菌試驗(yàn)結(jié)果（mm）

表1結(jié)果顯示，該凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)兩種革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)有不同程度的抑制作用。與傳統(tǒng)保加利亞乳桿菌相比，在對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)抑制方面性能稍弱，而對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)抑制方面性能接近。

2.2 不同培養(yǎng)條件對(duì)其菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)孢率的影響在對(duì)該菌株抗逆性及其對(duì)革蘭氏陰性菌生長(zhǎng)

抑制能力的研究基礎(chǔ)上，研究不同培養(yǎng)條件對(duì)其菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)孢率的影響。起始培養(yǎng)條件為pH值7.0，培養(yǎng)溫度37℃，接種量105cfu（稀釋種子菌液至105cfu/ml，移取1 000 μl至發(fā)酵培養(yǎng)基中），搖床轉(zhuǎn)速180 r/min。

2.2.1 菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定

用FP-1100-C型全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀（芬蘭OY Growth Curves公司生產(chǎn)）測(cè)定該菌株的生長(zhǎng)曲線，以確定其初步生長(zhǎng)特性。吸取凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液200 μl于蜂窩板孔中，設(shè)置培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為48 h，“快速”轉(zhuǎn)速檔培養(yǎng)，于600 nm處每小時(shí)測(cè)定一次吸光值，結(jié)果如圖4所示。

圖4 菌株生長(zhǎng)曲線

圖4顯示，該菌株培養(yǎng)0～4 h時(shí)處于生長(zhǎng)調(diào)整期，活菌數(shù)相對(duì)較少；在5～12 h處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，微生物以對(duì)數(shù)方式增殖，生長(zhǎng)速度最快；12～33 h處于穩(wěn)定期，活菌數(shù)在較高的范圍保持穩(wěn)定，新生和死亡達(dá)到平衡狀態(tài)；33 h后處于衰亡期，微生物由于培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和自身副產(chǎn)物的積累而不斷消亡，活菌數(shù)逐漸減少。

2.2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)其菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)孢率的影響

根據(jù)該菌株生長(zhǎng)曲線顯示，培養(yǎng)于12 h時(shí)進(jìn)入菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定期。試驗(yàn)設(shè)定培養(yǎng)時(shí)間分別為6、12、24、36、48 h。在不同培養(yǎng)時(shí)間后測(cè)定凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)和芽孢數(shù)，并計(jì)算其產(chǎn)孢率，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5顯示，活菌數(shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)先增大后減少，在12 h達(dá)到最大，而芽孢數(shù)在24 h最大，以最大芽孢數(shù)為優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)，選用24 h為最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間。

2.2.3 初始pH值對(duì)其菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)孢率的影響

試驗(yàn)設(shè)定液體培養(yǎng)基初始pH值分別為5.5、6、6.5、7、7.5。測(cè)定不同初始pH值條件下凝結(jié)芽孢桿菌的活菌數(shù)和芽孢數(shù)，并計(jì)算其產(chǎn)孢率，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6顯示，活菌數(shù)在pH=7時(shí)達(dá)到最大，但在此條件下產(chǎn)孢率較低導(dǎo)致芽孢數(shù)不高，而在pH=6.5時(shí)能獲得最大芽孢數(shù)，故選用初始pH=6.5為最佳pH值。

圖5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)其菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)孢率的影響

圖6 初始pH值對(duì)其菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)孢率的影響

2.2.4 培養(yǎng)溫度對(duì)其菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)孢率的影響

試驗(yàn)設(shè)定培養(yǎng)溫度分別為 25、30、37、40、45℃，測(cè)定在不同培養(yǎng)溫度條件下凝結(jié)芽孢桿菌的活菌數(shù)和芽孢數(shù)，并計(jì)算其產(chǎn)孢率，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 培養(yǎng)溫度對(duì)其菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)孢率的影響

圖7結(jié)果表明，該菌株在37℃時(shí)活菌數(shù)較高，但產(chǎn)孢率低下，在40℃時(shí)有較高的活菌數(shù)和產(chǎn)孢率，能獲得最大芽孢數(shù)，故本試驗(yàn)選用40℃為最佳培養(yǎng)溫度。

2.2.5 接種量對(duì)其菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)孢率的影響

試驗(yàn)分別設(shè)定接種量為103、104、105、106、107cfu。測(cè)定不同接種量下凝結(jié)芽孢桿菌的活菌數(shù)和芽孢數(shù)，并計(jì)算其產(chǎn)孢率，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 接種量對(duì)其菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)孢率的影響

圖8結(jié)果表明，當(dāng)接種量為104cfu時(shí)產(chǎn)孢率最大，但活菌數(shù)不高。接種量為106cfu時(shí)能獲得最大芽孢數(shù)，故本試驗(yàn)選用106cfu為最佳接種量。

2.2.6 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)其菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)孢率的影響

分別測(cè)定搖床轉(zhuǎn)速在 120、140、160、180、200 r/min條件下發(fā)酵后凝結(jié)芽孢桿菌的活菌數(shù)和芽孢數(shù)，并計(jì)算其產(chǎn)孢率，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)其菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)孢率的影響

圖9結(jié)果表明，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為140 r/min時(shí)，凝結(jié)芽孢桿菌生成的芽孢數(shù)多于其他轉(zhuǎn)速，故本試驗(yàn)選用140 r/min為最佳搖床轉(zhuǎn)速。

2.3 討論

2.3.1 抗逆性和抑菌性能分析

本試驗(yàn)證明了凝結(jié)芽孢桿菌BCRC11592具有優(yōu)秀的抗逆性能，而這種抗逆能力則與其本身能生成的芽孢體相關(guān)，這也應(yīng)證了國(guó)外之前某些研究的結(jié)果[12]。芽孢是某些細(xì)菌在停止生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生的休眠體，具有獨(dú)特而復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。其低水性的構(gòu)造和極低的新陳代謝作用使其在抗熱、抗化學(xué)物質(zhì)、抗輻射和抗靜水壓等方面有很好的表現(xiàn)[13]。該凝結(jié)芽孢桿菌在耐高溫方面的特性可以保證其在顆粒飼料制備過(guò)程中能保持高水平活菌數(shù)；同時(shí)在飼喂應(yīng)用中，其對(duì)強(qiáng)酸和膽鹽環(huán)境的耐受能力則能保證在胃液和腸液中的穩(wěn)定性，從而能有足夠的活菌數(shù)以發(fā)揮益生效用。而抑菌試驗(yàn)表明該凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)兩種革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。抑菌作用機(jī)制一般包括益生菌體分泌有機(jī)酸以降低腸道環(huán)境的pH值，與其它微生物競(jìng)爭(zhēng)環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，降低氧化還原電位，產(chǎn)生過(guò)氧化氫以及產(chǎn)生特定的抑菌素等[14]。該凝結(jié)芽孢桿菌的抑菌作用屬于哪種機(jī)制尚需進(jìn)一步研究，不過(guò)可以肯定其具有改善腸道微生態(tài)環(huán)境的能力。綜合以上結(jié)論，該菌株具備開(kāi)發(fā)為微生態(tài)飼料制劑的潛力。

2.3.2 產(chǎn)孢條件優(yōu)化結(jié)果分析

凝結(jié)芽孢桿菌為兼性厭氧菌，其所需的生長(zhǎng)環(huán)境相對(duì)較寬松。但由于芽孢體往往在環(huán)境惡劣、營(yíng)養(yǎng)缺乏的條件下生成，以抵御不良的外界因素。因此較適宜的溫度、pH值和較高搖床轉(zhuǎn)速能帶來(lái)更高的活菌數(shù)，但是不利于其芽孢體的生成。而過(guò)于惡劣的溫度、pH值以及過(guò)低的轉(zhuǎn)速則會(huì)影響菌體的正常生長(zhǎng)，菌體濃度過(guò)低，同樣不利于高芽孢數(shù)的獲得[15]。根據(jù)該菌體的生長(zhǎng)曲線可知，其在12 h可達(dá)到菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定期，具有最高的菌體濃度，而芽孢體往往形成于菌體生長(zhǎng)后期，本試驗(yàn)優(yōu)化后的24 h培養(yǎng)時(shí)間與該結(jié)論相吻合。

本試驗(yàn)通過(guò)搖瓶培養(yǎng)獲得最大芽孢數(shù)為3.0×108cfu/ml，而進(jìn)行發(fā)酵罐擴(kuò)大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)可能會(huì)有不同結(jié)果，此方面問(wèn)題尚待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，可得出以下結(jié)論：

①該凝結(jié)芽孢桿菌具有優(yōu)秀的抗逆性能，且這種抗逆能力與其本身能生成的芽孢體相關(guān)。

②該凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)兩種革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。

③該凝結(jié)芽孢桿菌的最佳產(chǎn)孢條件為培養(yǎng)時(shí)間24 h、培養(yǎng)溫度40℃、初始pH值為6.5、接種量為106cfu和搖床轉(zhuǎn)數(shù)為140 r/min，在此條件下菌液活菌數(shù)為3.5×108cfu/ml，芽孢數(shù)為3.0×108cfu/ml，產(chǎn)孢率為85.7%