■宋吉英

（青島農(nóng)業(yè)大學化學與藥學院，山東青島 266109）

色氨酸又名α-氨基-β-吲哚丙酸，有DL-、D-和L-色氨酸三種異構(gòu)體，天然存在的只有L-色氨酸，通常是仔豬日糧繼賴氨酸、蘇氨酸和蛋氨酸后的第四限制性氨基酸。研究表明，色氨酸可以調(diào)節(jié)動物肝臟蛋白質(zhì)的合成[1]，可以提高動物大腦中5-羥色胺的濃度，提高仔豬采食量，與攝食低色氨酸濃度的日糧相比，攝食高色氨酸濃度日糧的仔豬將表現(xiàn)出較好的生長性能[2]。目前，對色氨酸的測定，多采用不同濃度、不同種類強堿水解樣品，再用比色法、熒光法等方法定量[3-5]，本文重點探討用HPLC法測定有代表性的飼料原料和配合飼料。

本文選取飼料原料中的玉米蛋白粉和配合飼料中的乳豬教槽料，來考察用HPLC法測定色氨酸的含量。玉米蛋白粉是經(jīng)醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)淀粉或釀酒工業(yè)提純后的副產(chǎn)品，其蛋白營養(yǎng)成分可達60%以上，是飼料工業(yè)中常用的蛋白原料。教槽料俗稱補料或者開口料，是指乳豬出生7 d后到斷奶后7～10 d內(nèi)使用的特殊飼料[6-7]，其中原料的添加需重點考慮豬的消化率、適口性和可消化氨基酸的平穩(wěn)，因此需要添加一些優(yōu)質(zhì)的動物或植物蛋白。以上兩種材料經(jīng)堿水解后均可得到一定含量的色氨酸，是測定色氨酸含量比較有代表性的飼料原料和配合飼料。

1 儀器與試劑材料

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀（配有Agi?lent1260系列二極管陣列檢測器DAD），K241R型低溫高速離心機，UVIKON XS型紫外分光光度計，GZX-9240MBE型電熱鼓風干燥箱，KQ-600DE數(shù)控超聲波清洗器，Lab860型臺式酸度計，氮氣瓶，聚四氟乙烯螺紋口瓶。

1.2 試劑與溶液

甲醇(色譜純)，超純水(用前過0.45 μm濾膜)，4 mol/l氫氧化鋰溶液（一水合氫氧化鋰16.78 g，用水溶解并定容到100 ml容量瓶中），6 mol/l鹽酸溶液（將優(yōu)級純鹽酸與水等體積混合），0.008 5 mol/l乙酸鈉溶液（0.56 g無水乙酸鈉溶于800 ml水中，再用乙酸調(diào)節(jié)pH值至4.0，用0.45 μm濾膜過濾），L-色氨酸標準儲備液（準確稱取色氨酸標準品2.98 mg，用上述乙酸鈉溶液溶解，并定容到10 ml容量瓶中）。

1.3 材料

玉米蛋白粉和乳豬教槽料均來自于市購，烘干后粉碎，置于磨口瓶中保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品的前處理方法

稱取1.000 0 g待測飼料試樣，置于50 ml聚四氟乙烯螺紋口瓶中，加15 ml、4 mol/l氫氧化鋰溶液，置于碎冰中冷凍，并通氮氣6 min，擰緊瓶蓋，并用封口膜封瓶。將封好的聚四氟乙烯瓶放入(110±1)℃的干燥箱中，水解24 h。取出水解瓶，冷卻至室溫，開瓶，加入大約10 ml，6 mol/l的鹽酸中和，置于冰浴中緩慢滴加鹽酸，調(diào)節(jié)pH值在6左右，然后，上機用0.008 5 mol/l乙酸鈉溶液將水解液定量的轉(zhuǎn)移到100 ml容量瓶中定容。搖勻，靜置后取部分上清液于高速離心機中離心，離心后所得上清液過0.45 μm濾膜，然后封口置于冰箱中，供上機測定使用。

2.2 最佳吸收波長的選擇

為了確定色氨酸的最佳紫外吸收波長，用紫外分光光度計在200～400 nm波長范圍下掃描，得到如圖1所示的掃描光譜，表明色氨酸在222 nm和279 nm波長條件下有較強的吸收，為了避免溶劑或其他雜質(zhì)的干擾，所以本文選擇280 nm作為色氨酸的檢測波長。

2.3 色譜條件的選擇

色譜柱：Agilent C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；流動相：0.008 5 mol/l乙酸鈉溶液+甲醇=95+5；進樣量20 μl。在以上色譜條件下進行上機分析測定，得到的色氨酸標準品譜圖和兩種飼料樣品譜圖如圖2、圖3、圖4所示，色氨酸的出峰時間在13 min左右。

圖1 色氨酸在200～400 nm波長下的掃描光譜

圖3 玉米蛋白粉樣品色譜

圖4 乳豬教槽料樣品色譜

2.4 標準溶液的制備及標準曲線的繪制

取2 ml L-色氨酸標準儲備液，采用流動相逐級稀釋法配成一系列不同濃度的L-色氨酸標準品溶液，在2.3節(jié)的色譜條件下進行分析。得到的譜圖以濃度c為橫坐標，峰面積A為縱坐標繪制標準曲線，如圖5所示，回歸方程為：A=30.891 7c-0.562 8，結(jié)果表明，色氨酸在4.646～298 mg/ml范圍內(nèi)，峰面積與其濃度線性關系良好(r=0.999 9)，計算得檢出限為0.033 5 mg/ml。

圖5 色氨酸標準工作曲線

2.5 前處理方法的精密度考察

分別取玉米蛋白粉和乳豬教槽料三份平行樣進行前處理，處理后的樣品按2.3節(jié)的色譜條件進行檢測，得到三份玉米蛋白粉中色氨酸的平均含量為0.331%，測定量RSD值為3.67%；三份乳豬教槽料中色氨酸的平均含量為0.268%，測定量RSD值為0.94%。結(jié)果表明，前處理方法的精密度良好，該前處理方法適合飼料中色氨酸的測定。

2.6 檢測方法的精密度考察

將玉米蛋白粉和乳豬教槽料經(jīng)處理后的上機待測樣品分別在高效液相色譜上連續(xù)進樣5次，按2.3節(jié)的色譜條件進行測定。玉米蛋白粉中色氨酸的平均含量為0.345%，測定量RSD值為0.640%；乳豬教槽料中色氨酸的平均含量為0.266%，測得量RSD值為0.471%。結(jié)果表明，用高效液相色譜法測定色氨酸的含量具有良好的精密度。

2.7 空白加標回收

準確稱取3份1.00 g不含氨基酸的飼料載體，各加入100 ml色氨酸標準儲備液，用同樣的前處理方法進行處理，用2.3節(jié)的色譜條件檢測，結(jié)果（見表1）表明，平均回收率為99.04%，加入的色氨酸基本沒有損失，該前處理方法準確、可靠。

表1 空白加標回收率測定結(jié)果

3 小結(jié)

本文建立了用高效液相色譜法測定玉米蛋白粉和乳豬教槽料中色氨酸的試驗方法。本方法樣品前處理將國標上的聚四氟乙烯襯管換成聚四氟乙烯螺紋口瓶，操作簡單，色譜條件容易掌握，大大縮短了試驗時間。方法的精密度和空白回收率都較高，完全可以滿足分析要求，是測定飼料原料和配合飼料中色氨酸含量的可行有效的方法。