呂淑霞，高 明，馬 鏑，于曉丹，張忠澤，陳宏權

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，遼寧 沈陽 110866；2.中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所，遼寧 沈陽 110016；3.東北制藥總廠VC公司，遼寧 沈陽 110028)

VC是含有6個碳原子的酸性多羥基化合物，又名L-抗壞血酸(L-ascorbic acid)。參與體內(nèi)多種羥化及氧化還原反應，具有抗氧化性、提高機體免疫力、解毒、抗癌等作用[1]，被廣泛應用于醫(yī)藥、食品、化妝品、飼料等行業(yè)。VC二步發(fā)酵法[2]是由我國自主研發(fā)的生物發(fā)酵法，主要由醇糖轉(zhuǎn)化以及糖酸轉(zhuǎn)化兩步組成，其中第二步轉(zhuǎn)化反應由兩種細菌混合發(fā)酵完成，產(chǎn)酸菌為氧化葡萄糖酸桿菌，單獨培養(yǎng)生長緩慢，傳代困難，且產(chǎn)酸能力很弱；伴生菌為芽孢桿菌，易培養(yǎng)，不產(chǎn)酸，但與產(chǎn)酸菌混合培養(yǎng)可促進產(chǎn)酸菌生長及產(chǎn)酸[3]，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種菌種均可以作為伴生菌，例如：巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、條紋假單胞菌(Pseudomonas striaia)、擲孢酵母(Sporoblomyces roseu)等[4-5]。但目前VC生產(chǎn)菌系較單一、生產(chǎn)菌種的轉(zhuǎn)化率難以大幅度提升、原料利用率偏低，因此國內(nèi)外學者不斷進行技術革新，并致力于篩選轉(zhuǎn)化率高、發(fā)酵速率快的優(yōu)良菌系用于提高VC產(chǎn)量，進而提高設備利用率、降低生產(chǎn)成本[6]。本實驗室篩選到一株枯草芽孢桿菌具有很好的伴生能力，可以有效提高產(chǎn)酸量并且使發(fā)酵終點提前，糖酸轉(zhuǎn)化率可達94%左右，既降低成本又提高生產(chǎn)效率，具有很好的應用前景。常規(guī)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基多為其他因素固定，每次只研究—個變化因素[7]，這種研究方法效率低，且容易忽略因素間的交互作用而得出錯誤的結(jié)論，不能實現(xiàn)真正的最優(yōu)化。響應面法是多變量系統(tǒng)尋優(yōu)的試驗策略，已成功應用于許多生物過程培養(yǎng)基和操作條件的優(yōu)化[8-9]。本實驗采用響應面設計法[10-13]的中心組合試驗設計(central composite design，CCD)優(yōu)化VC二步發(fā)酵培養(yǎng)基，最終得到較好的培養(yǎng)基配比，以提高2-酮基-L-古龍酸(2-keto-L-gulonic acid，2-KGA)產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)與巨大芽孢桿菌2980(Bacillus megaterium2980)均由東北制藥總廠提供。枯草芽孢桿菌A9(Bacillus subtilisA9)，由本實驗室篩選并保藏。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：L-山梨糖80、玉米漿10、尿素 12、KH2PO41、MgSO40.2、CaCO35，pH 6.7～7.0。

1.2 儀器與設備

萬分之一電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；LDZX型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇國華電器有限公司；HZP-250型全溫振蕩培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設備有限公司；超凈工作臺 蘇州蘇凈集團安泰公司；UB-7型pH計 北京丹佛儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

分別挑取大小菌到無菌水中，然后挑一環(huán)大菌懸液于小菌懸液中，搖勻制成大小菌混懸液。用滅菌的接種環(huán)蘸取一環(huán)大小菌混懸液于空白培養(yǎng)過的試管斜面上劃線，如此反復15～20次，直至斜面表面濕潤，倒置培養(yǎng)2～3d(29℃)。將混菌斜面接種于種子培養(yǎng)基中，于29℃、180r/min培養(yǎng)24h。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的種液以10%的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于29℃、180r/min培養(yǎng)48h。

1.4 分析方法

1.4.1 2-酮基-L-古龍酸測定

采用碘量法[14]測定。

1.4.2 響應面試驗設計

單因素試驗：通過固定其他成分而改變發(fā)酵培養(yǎng)基中一個組分(碳源、氮源、無機離子)的質(zhì)量濃度，從而得出優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基，以上試驗均采用的發(fā)酵條件為29℃、180r/min搖床培養(yǎng)48h。

在單因素試驗的基礎上，借助Design Expert軟件，采用中心組合試驗設計原理，選取L-山梨糖、尿素、玉米漿、CaCO3、MgSO4添加量為試驗因素，以2-KGA產(chǎn)量為指標，進行響應面分析，試驗因素水平設計見表1。

表1 試驗因素水平及編碼Table 1 Factors, levels and codes of response surface tests

表1自變量編碼方程為：xi=(Χi－Χ0)/ΔX，式中：xi為自變量的編碼值；Χi為自變量的實際試驗水平值；Χ0為試驗水平中心點的實際值；ΔΧ為單變量增量。因此，編碼值與真實值之間的關系為：x1=(Χ1－80)/10；x2=(Χ2－12)/2；x3=(Χ3－14)/2；x4=Χ4－4；x5=(Χ5－0.2)×10。根據(jù)中心組合試驗設計方案進行試驗，用統(tǒng)計軟件Design Expert 7.0對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，可推測出最佳培養(yǎng)基添加量組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同伴生菌伴生能力比較

表2 不同伴生菌與產(chǎn)酸菌混合搭配搖瓶發(fā)酵產(chǎn)2-KGA能力比較Table 2 Comparison of 2- KGA-producing ability of G.oxydans companying with different companion strains

由表2可知，伴生菌B.subtilisA9的促產(chǎn)酸能力明顯高于生產(chǎn)用伴生菌B.megaterium2980。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1L-山梨糖添加量對發(fā)酵的影響

圖1 不同L-山梨糖添加量對新菌系G.oxydans+B.subtilis A9產(chǎn)酸及轉(zhuǎn)化率的影響Fig.1 Effect of L-sorbose concentration on 2-KGA production and conversion rate by strains of G.oxydans+B.subtilis A9

由圖1可知，當L-山梨糖起始質(zhì)量濃度為70g/L時，轉(zhuǎn)化率高達99.42%，但是在大生產(chǎn)中投糖量過低會造成其他資源的浪費，降低設備的有效利用率，提高發(fā)酵成本。當L-山梨糖的起始質(zhì)量濃度為90g/L時產(chǎn)酸量最高，但是糖酸轉(zhuǎn)化率較低，而當糖質(zhì)量濃度大于90g/L時，產(chǎn)酸量開始略微下降，這可能是因為過高的糖質(zhì)量濃度會抑制菌體產(chǎn)酸，導致發(fā)酵時間延長。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)起始糖質(zhì)量濃度80g/L與90g/L產(chǎn)酸量相差較小，并且80g/L糖酸轉(zhuǎn)化率較高，因而采用80g/L的起始糖質(zhì)量濃度最為合適。

2.2.2 尿素添加量對發(fā)酵的影響

圖2 不同尿素添加量對新菌系G.oxydans+B.subtilis A9產(chǎn)酸的影響Fig.2 Effect of urea addition amount on 2-KGA production and conversion rate by strains of G.oxydans+B.subtilis A9

在微生物生長過程中尿素不僅作為氮源，而且也作為一種生理堿調(diào)節(jié)微生物生長的pH值環(huán)境[15]。本實驗通過梯度分析尿素質(zhì)量濃度對混合菌發(fā)酵的影響，由圖2可知，2-酮基-L-古龍酸的產(chǎn)量隨著尿素質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中在尿素質(zhì)量濃度為12g/L，產(chǎn)酸量最高，當質(zhì)量濃度低于12g/L時，反應未到終點尿素已消耗完，不能對小菌產(chǎn)酸發(fā)揮很好的作用，而高于12g/L會抑制菌體的生長，致使產(chǎn)酸量下降。因此選擇的最優(yōu)尿素質(zhì)量濃度為12g/L。

2.2.3 玉米漿添加量對發(fā)酵的影響

圖3 不同玉米漿添加量對新菌系G.oxydans+B.subtilis A9產(chǎn)酸的影響Fig.3 Effect of corn liquor amount on 2-KGA production and conversion rate by strains of G.oxydans+B.subtilis A9

由圖3可知，隨著玉米漿質(zhì)量濃度的上升，2-KGA產(chǎn)量呈現(xiàn)上升趨勢。當玉米漿質(zhì)量濃度為14g/L時產(chǎn)酸量基本達到最高值，之后隨著玉米漿質(zhì)量濃度的增加，產(chǎn)酸量基本相同。即玉米漿質(zhì)量濃度在14g/L時已可滿足大菌生長和小菌產(chǎn)酸的營養(yǎng)需求，因此選擇的最優(yōu)玉米漿含量為14g/L。

2.2.4 不同CaCO3添加量對發(fā)酵的影響

圖4 不同CaCO3添加量對新菌系G.oxydans+B.subtilis A9產(chǎn)酸的影響Fig.4 Effect of CaCO3 amount on 2-KGA production and conversion rate by strains of G.oxydans+B.subtilis A9

由圖4可知，隨著CaCO3質(zhì)量濃度的增加，2-KGA產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當CaCO3質(zhì)量濃度為5g/L時混合菌系產(chǎn)酸量最高，低于或高于該質(zhì)量濃度菌系產(chǎn)酸量都稍低，這是由于過低的CaCO3質(zhì)量濃度不利于緩沖發(fā)酵液中的酸，造成酸的反饋抑制作用，不利于大菌的生長；而較高的CaCO3質(zhì)量濃度又會抑制菌體生長，降低菌系產(chǎn)酸量。因此選擇的最優(yōu)CaCO3質(zhì)量濃度為5g/L。

2.2.5 不同MgSO4添加量對發(fā)酵的影響

圖5 不同MgSO4添加量對新菌系G.oxydans+B.subtilis A9產(chǎn)酸的影響Fig.5 Effect of MgSO4 amount on 2-KGA production and conversion rate by strains of G.oxydans+B.subtilis A9

由圖5可知，隨著MgSO4質(zhì)量濃度的增加，2-KGA產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當MgSO4質(zhì)量濃度為0.2g/L時，菌系的產(chǎn)酸量最高，而當質(zhì)量濃度高于0.2g/L時2-KGA產(chǎn)量降低，產(chǎn)生抑制作用。據(jù)報道[16]，2-KGA在還原酶作用下生成L-艾杜糖酸，推測高質(zhì)量濃度MgSO4激活了2-KGA還原酶，使2-KGA進一步還原成L-艾杜糖酸，使得2-KGA的得率下降。與本結(jié)果一致。

2.3 響應面法優(yōu)化VC二步混合菌發(fā)酵培養(yǎng)基

按照中心組合試驗方案進行五因素五水平試驗，試驗結(jié)果見表3。

利用Design Expert對表3中試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸設計及分析，獲得2-KGA產(chǎn)量對5個編碼自變量L-山梨糖(x1)、尿素(x2)、玉米漿(x3)、CaCO3(x4)、MgSO4(x5)的二次多項回歸方程(模型1)：

表3 中心組合試驗設計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface central composite tests

2.3.1 回歸方程方差分析

對模型方程回歸系數(shù)進行顯著性檢驗分析見表4。對模型方差分析結(jié)果表明，相關系數(shù)R2=0.9892，校正系數(shù)=0.9696，本試驗所選用模型(1)具有高度的顯著性(P＜0.0001)，說明該方程與實際情況擬合良好，可以用該方程代替真實實驗點進行分析。對回歸方程系數(shù)進行顯著性檢驗(表4)，表明x1、x3、、、x32、、對2-KGA產(chǎn)量有極顯著影響((P＜0.0001)；x2、x1x3對2-KGA產(chǎn)量影響顯著(P＜0.05)，其他項系數(shù)均不顯著。依據(jù)系數(shù)估計值x1=3.03、x2=0.32、x3=0.86、x4=0.27、x5=0.024可知因素的主效應關系為L-山梨糖＞玉米漿＞尿素＞碳酸鈣＞硫酸鎂。在α=0.05顯著水平下剔除不顯著項后，對模型(1)進行優(yōu)化可得模型(2)：

表4 回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance for the fitted regression equation with 2-KGA yield as a function

2.3.2 響應面分析與優(yōu)化

根據(jù)CCD模型建立的二次回歸方程，固定3個因素在編碼值0的水平，分析另外兩因素對2-KGA產(chǎn)量的影響，利用Design Expert軟件進行響應面曲線圖分析，探討各因素及其交互作用對響應值的影響。

選取顯著性影響因素L-山梨糖、玉米漿、尿素為主要研究對象，結(jié)果分析可知，低水平和高水平的影響因素都不利于2-KGA產(chǎn)量的提高。比較圖3的曲面圖可知，L-山梨糖對2-KGA產(chǎn)量影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，隨著L-山梨糖含量的提高產(chǎn)酸量逐漸增加，但當L-山梨糖添加量大于87g/L時響應值提高緩慢。因此，從成本考慮選擇的L-山梨糖添加量為85～90g/L；尿素和玉米漿均隨其添加量的提高，產(chǎn)酸量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，從變化速率來看，玉米漿組分的主效應大于尿素。由此可知，在試驗水平內(nèi)，適當?shù)脑黾覮-山梨糖添加量有利于2-KGA產(chǎn)量的提高。在各因素中L-山梨糖與玉米漿的交互作用顯著(圖6B)。采用Design Expert軟件完成優(yōu)化，得到的優(yōu)化結(jié)果為：L-山梨糖90g/L、尿素12.2g/L、玉米漿14.2g/L、CaCO34.1g/L、MgSO40.2g/L，在此條件下2-KGA產(chǎn)量為70.33g/L。

圖6 兩因素交互作用對2-KGA產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of cross-interaction between two factors on 2-KGA production

2.3.3 驗證實驗

為了檢驗模型預測的準確性，利用優(yōu)化后的營養(yǎng)條件(L-山梨糖90g/L、尿素12.2g/L、玉米漿14.2g/L、CaCO34.1g/L、MgSO40.2g/L)進行發(fā)酵實驗，3次重復，所測得的2-KGA產(chǎn)量分別是69.22、68.84、71.15g/L，3次重復的平均值為69.74g/L。實際實驗值與模型預測值基本一致，可見該模型能較好地預測實際發(fā)酵產(chǎn)酸的情況。

3 結(jié) 論

用響應面分析法(RSM)建立了VC二步混合菌發(fā)酵培養(yǎng)基的數(shù)學模型。響應面法的試驗統(tǒng)計方法能快速、有效地對影響發(fā)酵的設定因素實現(xiàn)條件優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基條件。其中L-山梨糖對小菌的生長和產(chǎn)酸至關重要；玉米漿中含有多種氨基酸，可提供多種營養(yǎng)物質(zhì)供菌體生長，是影響2-KGA產(chǎn)量的另一重要因素[17]；而尿素作為氮源是促進菌體生長的必需營養(yǎng)元素，并且有利于中和發(fā)酵周期中的酸性環(huán)境；無機鹽類是微生物生命活動不可缺少的物質(zhì)，其主要功能是參與構(gòu)成菌體成分、作為酶的組成部分或維持酶的活性、調(diào)節(jié)滲透壓等，本研究中選取碳酸鈣和硫酸鎂為主要研究的無機鹽類物質(zhì)。響應面法獲得的VC二步混合菌發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基為：L-山梨糖90g/L、尿素12.2g/L、玉米漿14.2g/L、CaCO34.1g/L、MgSO40.2g/L。經(jīng)軟件分析得到2-KGA產(chǎn)量驗證值為70.33g/L；通過新菌系經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后，其48h產(chǎn)酸量為69.74g/L，明顯高于優(yōu)化前產(chǎn)酸量59.42g/L，平均提高17.4%。二步發(fā)酵法研究初期，從L-山梨糖到2-酮基-L-古龍酸的轉(zhuǎn)化率僅為39.7%(糖質(zhì)量濃度70g/L)[18]，經(jīng)多方面改進，目前現(xiàn)用生產(chǎn)菌系轉(zhuǎn)化率可達85%(糖質(zhì)量濃度80～100g/L)左右；郭禮強等[19]利用紫外線(UV)、亞硝基胍(NTG)及兩者的復合誘變方法選育得到一株蘇云金芽孢桿菌UN-366，轉(zhuǎn)化率達到89.2%；仲崇斌等[20]以擲孢酵母作為伴生菌與氧化葡萄糖酸桿菌組成新混菌體系，轉(zhuǎn)化率達66.81%。本實驗室新菌系經(jīng)優(yōu)化后發(fā)酵終點糖酸轉(zhuǎn)化率可達到94%左右(糖質(zhì)量濃度90g/L)，明顯優(yōu)于現(xiàn)用生產(chǎn)菌系。實驗經(jīng)檢驗證明，該搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)2-KGA的工藝參數(shù)合理可靠。

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