李海鵬，孫 泊

(1.上海體育學(xué)院 運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院，上海 200438;2.臺(tái)州學(xué)院 體育科學(xué)學(xué)院，浙江 臨海 317000;3.聊城大學(xué) 體育學(xué)院，山東聊城 252059)

新近研究發(fā)現(xiàn)，除了原有兩條經(jīng)典凋亡途徑(①TNF－α/Fas 介導(dǎo)的外源性死亡受體途徑和②線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性損傷途徑)以外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)途徑也參與了細(xì)胞凋亡過程［1］。對(duì)于骨骼肌而言，細(xì)胞凋亡不僅可以經(jīng)由不同凋亡途徑發(fā)生，而且在各條途徑中還會(huì)涉及到諸多紛繁復(fù)雜的細(xì)胞凋亡分子事件(如Caspase 家族的級(jí)聯(lián)激活事件)。盡管目前已有不少關(guān)于運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌細(xì)胞凋亡影響的研究，但是現(xiàn)有研究多圍繞原有兩條經(jīng)典凋亡途徑展開，而針對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(Endoplasmic Reticulum Stress，ERS)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中相關(guān)基因的研究少有報(bào)道［2］，一定程度上限制了研究者對(duì)運(yùn)動(dòng)與骨骼肌細(xì)胞凋亡過程中各凋亡途徑之間的關(guān)系以及運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)骨骼肌發(fā)生細(xì)胞凋亡機(jī)制等方面的認(rèn)識(shí)［3－4］。鑒于此，本研究擬通過對(duì)小鼠分別進(jìn)行8 周跑臺(tái)、爬梯運(yùn)動(dòng)干預(yù)，觀察運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠骨骼肌ERS 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)活性以及相關(guān)基因(m－Calpain、Caspase－12 和Caspase－3)mRNA 表達(dá)的影響，為今后揭示運(yùn)動(dòng)與骨骼肌細(xì)胞凋亡各條凋亡途徑之間的關(guān)系提供一些參考。

1 研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

3 月齡雄性SAMP8 小鼠24 只(體重:28.1 ±2.3 g)，購(gòu)自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證編號(hào):W－J 津?qū)崉?dòng)質(zhì)M 準(zhǔn)字第006 號(hào))，購(gòu)入后隨機(jī)分為3 組:安靜對(duì)照組(C 組)、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組(E 組)和爬梯運(yùn)動(dòng)組(R 組)，每組各8 只，在SPF 條件下分籠飼養(yǎng)，以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類飼料喂養(yǎng)，自由飲食、飲水。光照遵循明暗周期，溫度范圍20 ℃±2 ℃，相對(duì)濕度55%±5%。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，E 組采用動(dòng)物跑臺(tái)進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)［5］，具體運(yùn)動(dòng)方案為:第1 周15 m/min×15 min;第2 周為20 m/min×25 min;第3 周為25 m/min×25 min;第4 周為25 m/min×30 min;第5 ～8 周均為30 m/min×30 min，每天1 次，每周5 天，持續(xù)8 周。R 組采用負(fù)重爬梯進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)，具體運(yùn)動(dòng)方案為:第1 周負(fù)重50%BW;第2 周負(fù)重50%BW;第3 周負(fù)重66%BW;第4 周負(fù)重83%BW;第5 ～7 周負(fù)重100%BW;第8 周負(fù)重83%BW，其中除第1 周訓(xùn)練安排為每天3組，每組3 次以外，第2 ～8 周均為每天3 次，每組4次。每次爬梯間隔時(shí)間為20 s，每組間隔時(shí)間為2 min，訓(xùn)練隔天1 次，持續(xù)8 周。所有訓(xùn)練時(shí)間選擇在暗周期(18:00 ～20:00)進(jìn)行。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)取材

末次運(yùn)動(dòng)后24 h ～48 h，小鼠斷頭處死，迅速取完整后肢腓腸肌并分成兩份，一份用于CaN 活性檢測(cè)，另一份錫箔紙包裹并標(biāo)記后迅速置于液氮中，后移至－80℃超低溫冰箱保存。

1.3.2 DNA ladder 檢測(cè)

細(xì)胞凋亡采用DNA ladder 試劑盒(購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行，通過凝膠電泳觀察有無梯狀條帶。

1.3.3 CaN 活性檢測(cè)

CaN 活性的檢測(cè)參照南京建成生物技術(shù)研究所提供的CaN 試劑盒說明書進(jìn)行，主要用于反映細(xì)胞中Ca2+濃度的變化。

1.3.4 總RNA 的提取、逆轉(zhuǎn)錄及Real－time PCR 擴(kuò)增

骨骼肌總RNA 的提取及RNA 完整性與純度的檢測(cè)參照文獻(xiàn)［6］進(jìn)行，經(jīng)檢驗(yàn)總RNA 的完整性與純度均較好。然后，取RNA 2 μl 以O(shè)ligo(dT)15(50 pmol/μl)為隨機(jī)引物RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。Real－time PCR擴(kuò)增引物由Pubmed 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行目的基因全序列查找，采用Primer Express 3.0 引物設(shè)計(jì)軟件由上海捷瑞生物公司合成，引物序列及相關(guān)信息見表1。

Realtime PCR 反應(yīng)體系為20 μL，其中SYBR Premix(TOYOBO 公司)10 μL，正、反向引物(10 μM)各1 μL，模板4 μL，然后用無RNase 水補(bǔ)足。反應(yīng)條件為95 ℃，3 min 預(yù)變性;擴(kuò)增階段為95 ℃，20 s，Tm℃，20 s，72 ℃，20 s(收集熒光)，45 個(gè)循環(huán);產(chǎn)物特異性檢測(cè)階段95 ℃，1 min;Tm ℃，20 s;緩慢升溫(收集熒光)至95 ℃，10 s。經(jīng)儀器自動(dòng)分析，各基因融解曲線均為單峰，表明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較高。以β－actin為內(nèi)參基因，各目的基因的相對(duì)量Relative Expression(RE)按照2－ΔΔCt計(jì)算求得。

表1 各基因引物序列及相關(guān)信息

1.4 數(shù)據(jù)處理

由SPSS for windows15.0 統(tǒng)計(jì)軟件包運(yùn)用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所得數(shù)據(jù)以ˉx± s 表示，差異顯著性水平定義為P〈0.05。

2 研究結(jié)果

2.1 細(xì)胞凋亡的初步檢測(cè)

經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，C 組、E 組和R 組均未見階梯狀DNA Ladder，可以初步推斷在各組小鼠骨骼肌均未呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡特征(圖略)。

2.2 運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠骨骼肌中CaN 活性的影響

與C 組相比，E 組和R 組小鼠骨骼肌中CaN 活性均顯著升高(P〈0.05)(見表2)。

表2 運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠骨骼肌中CaN 活性的影響

2.3 運(yùn)動(dòng)對(duì)ERS 凋亡途徑中相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的影響

與C 組相比，E 組和R 組小鼠骨骼肌中m－Calpain 與Caspase－12 mRNA 水平均分別顯著升高(P〈0.05)，但R 組小鼠骨骼肌中Caspase－3 mRNA 水平較C 組呈顯著下降(P〈0.05)，而E 組小鼠骨骼肌中Caspase－3 mRNA 水平卻未見顯著性變化(P〉0.05)(見表3)。

表3 運(yùn)動(dòng)對(duì)ERS 途徑中相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的影響

3 分析與討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)Ca2+儲(chǔ)備的主要場(chǎng)所。已有研究表明，運(yùn)動(dòng)應(yīng)激能夠引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+離子通道狀態(tài)的改變，從而破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)，通過造成胞內(nèi)鈣的失衡，干擾蛋白質(zhì)的正常合成、翻譯與折疊過程，并促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白和錯(cuò)誤折疊蛋白生成增多超過閾值，最終產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(ERS)。李煥春等人曾提出，ERS 不僅是細(xì)胞抵抗應(yīng)激的重要機(jī)制，更是應(yīng)激細(xì)胞發(fā)生損傷的重要原因。適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激利于細(xì)胞生理機(jī)能的發(fā)揮，然而當(dāng)應(yīng)激強(qiáng)度過高時(shí)，細(xì)胞會(huì)通過啟動(dòng)各種信號(hào)機(jī)制引發(fā)細(xì)胞凋亡［7］。符民桂等研究者認(rèn)為，一般而言，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面:一個(gè)是對(duì)Ca2+的調(diào)控，另一個(gè)就是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)［8］。當(dāng)然在ERS 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中Ca2+也仍然發(fā)揮著重要的媒介作用，在受Ca2+信號(hào)調(diào)節(jié)的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)、鈣蛋白酶(m－Calpain)、Caspase－12 以及Caspase－3 等分別構(gòu)成了ERS 介導(dǎo)凋亡的下游凋亡分子事件，運(yùn)動(dòng)應(yīng)激對(duì)這些分子事件的影響一定程度上反映了運(yùn)動(dòng)與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系(如圖1)。

圖1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡示意圖

李愛玲等人的研究指出，CaN 是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一受Ca2+/鈣調(diào)素(CaM)調(diào)節(jié)的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，是細(xì)胞信號(hào)傳遞中的效應(yīng)酶和調(diào)節(jié)酶，在骨骼肌等組織細(xì)胞中作為Ca2+信號(hào)下游的一種效應(yīng)分子參與多種受Ca2+信號(hào)調(diào)節(jié)的細(xì)胞事件，CaN 的激活往往意味著［Ca2+］的升高［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與C 組相比，E組和R 組小鼠骨骼肌中CaN 的活性均顯著性升高(P〈0.05)，表明無論是有氧運(yùn)動(dòng)還是抗阻運(yùn)動(dòng)都可能造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+過度升高進(jìn)而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，使得Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被釋放入細(xì)胞質(zhì)激活CaN。此外，鈣蛋白酶(Calpain)是一種Ca2+依賴性的半胱氨酸蛋白酶，其非組織特異性Calpain 主要有μ－Calpain和m－Calpain 兩種形式，二者除活化時(shí)需要的Ca2+不同以外，生化和催化的性質(zhì)幾乎完全相同。Saido 等人的研究認(rèn)為，由于細(xì)胞內(nèi)Ca2+的波動(dòng)在微摩爾(μmol)濃度水平以下，所以μ－Calpain 很可能在正常生理?xiàng)l件下發(fā)揮功能，而m－Calpain 則主要在生理異常甚至病理情況(如細(xì)胞內(nèi)鈣超載條件)下才能激活［10］，因此，本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)小鼠骨骼肌中m－Calpain 進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E 組和R 組小鼠骨骼肌中m－Calpain mRNA 表達(dá)均較C 組顯著升高(P〈0.05)，意味著兩種形式的運(yùn)動(dòng)均能夠在引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)釋放Ca2+的同時(shí)促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)附近的m－Calpain 的表達(dá)。

Xu 等研究認(rèn)為，m－Calpain 表達(dá)的上調(diào)只是ERS介導(dǎo)的凋亡途徑中的一個(gè)中間信號(hào)事件，當(dāng)m－Calpain 被激活后，它將繼續(xù)作用于其底物(如Bax、Bid、Caspase－12)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其中在后續(xù)凋亡過程中起重要作用的是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜的Caspase－12，它在死亡受體或線粒體凋亡途徑中始終處于失活狀態(tài)，Caspase－12 表達(dá)的增加將意味著運(yùn)動(dòng)應(yīng)激誘發(fā)的凋亡信號(hào)能夠通過ERS 途徑來引發(fā)凋亡［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與C 組相比，E 組和R 組小鼠骨骼肌中Caspase－12 mRNA 表達(dá)均顯著升高(P〈0.05)，表明m－Calpain 被激活后確實(shí)將凋亡信號(hào)傳遞至ERS介導(dǎo)的凋亡途徑中特異凋亡因子－Caspase－12。那么如果再經(jīng)由Caspase－12 引發(fā)凋亡主效應(yīng)因子—Caspase－3 的表達(dá)上調(diào)，就會(huì)導(dǎo)致蛋白降解誘發(fā)細(xì)胞凋亡。

然而出乎意料的是，與C 組相比，E 組和R 組小鼠骨骼肌中Caspase－3 mRNA 表達(dá)均未呈現(xiàn)出促凋亡的上調(diào)趨勢(shì)，尤其在R 組Caspase－3 mRNA 表達(dá)反而有所下降，且具有顯著性差異(P〈0.05)，而E 組Caspase－3 mRNA 表達(dá)則未見任何顯著性變化(P〉0.05)。無論E 組還是R 組之所以未能呈現(xiàn)出預(yù)期的上調(diào)表達(dá)，究其原因可能在于Caspase－3 是多條凋亡通路的交叉點(diǎn)，由另外兩條凋亡途徑中的某一條途徑或者兩條途徑同時(shí)所引發(fā)的細(xì)胞凋亡在Caspase－3這一交叉點(diǎn)上發(fā)生了效應(yīng)迥異的分子事件，而ERS 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在Caspase－3 基因的最終表現(xiàn)上由于其促凋亡效應(yīng)被抵消等原因使得Caspase－3 在整體效應(yīng)上有所保留，最終呈現(xiàn)一定的凋亡隱性表征。

4 結(jié)語

綜上所述，雖然運(yùn)動(dòng)應(yīng)激能夠引發(fā)小鼠骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，但是并未能夠?qū)⒂蓱?yīng)激反應(yīng)引發(fā)的凋亡作用最終級(jí)聯(lián)放大在Caspase－3 上得以顯性表征，導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞凋亡的必然發(fā)生，甚至對(duì)于抗阻運(yùn)動(dòng)而言，反而表現(xiàn)出一定的抑制凋亡趨勢(shì)。此外，在運(yùn)動(dòng)與骨骼肌細(xì)胞凋亡各凋亡途徑的關(guān)系中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)途徑較之于原有兩條經(jīng)典凋亡途徑在致凋亡的作用上可能存在一定的弱勢(shì)效應(yīng)。盡管如此，相信隨著今后相關(guān)研究的逐步深入，ERS 介導(dǎo)的凋亡途徑仍將為我們提供一個(gè)獨(dú)特的視角來了解運(yùn)動(dòng)與骨骼肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系。

［1］Tabas I，Ron D.Integrating the mechanisms of apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress［J］.Nat Cell Biol.2011，13(3):184－190.

［2］Quadrilatero J，Bombardier E，Norris SM，et al.Prolonged moderate－intensity aerobic exercise does not alter apoptotic signaling and DNA fragmentation in human skeletal muscle［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab.2010，298(3):E534－547.

［3］Carraro U，F(xiàn)ranceschi C.Apoptosis of skeletal and cardiac muscles and physical exercise［J］.Aging(Milano).1997; 9(1－2):19－34.

［4］Phaneuf S，Leeuwenburgh C.Apoptosis and exercise［J］.Med Sci Sports Exerc.2001，33(3):393－396.

［5］李海鵬，楊東升，王立豐，等.跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)Sarcopenia 小鼠Caspase 依賴與非依賴凋亡基因mRNA 表達(dá)的影響［J］.中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2011，30(7):625－629.

［6］李海鵬，王立豐，關(guān)尚一，等.Sarcopenia 關(guān)聯(lián)的線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的增齡性變化及爬梯運(yùn)動(dòng)對(duì)其的影響［J］.體育科學(xué)，2010，30(7):56－61.

［7］李煥春，肖國(guó)強(qiáng).內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和熱休克與運(yùn)動(dòng)［J］.體育學(xué)刊，2009，16(1):109－112.

［8］符民桂，唐朝樞.鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的研究進(jìn)展［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2000，27(2):157－161.

［9］李愛玲，修瑞娟.鈣聯(lián)蛋白調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，31(3):335－338.

［10］Saido TC，Sorimachi H，Suzuki K.Calpain: new perspectives in molecular diversity and physiological－pathological involvement［J］.FASEB J.1994，8(11):814－822.

［11］Xu C，Bailly－Maitre B，Reed JC.Endoplasmic reticulum stress:cell life and death decisions［J］.J Clin Invest.2005，115(10):2656－2664.