馬含笑，李春，2，周曉宏

（1.石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081）

真空包裝醬豬肝中污染微生物的分離鑒定和抑菌研究

馬含笑1，李春1，2，周曉宏2，*

（1.石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081）

對(duì)腐敗醬豬肝中的污染微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)和純化，篩選到最適培養(yǎng)基結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基VRBGA，得到了3種不同的污染微生物。經(jīng)16S rDNA鑒定，一株球菌為血居吸蟲腸球菌，兩株桿菌分別為普通變形桿菌和豬糞便細(xì)菌。污染微生物的單一防腐劑研究表明，對(duì)血居吸蟲腸球菌，Nisin、聚賴氨酸、單辛酸甘油酯和殼聚糖具有較好的抑菌作用，最小抑菌濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.2 mg/mL；對(duì)普通變形桿菌，脫氫醋酸鈉、單辛酸甘油酯、D-異抗壞血酸和殼聚糖具有較好的抑菌作用，最小抑菌濃度分別為0.8、0.4、0.6、0.2 mg/mL；對(duì)豬糞便細(xì)菌，脫氫醋酸鈉、單辛酸甘油酯和殼聚糖具有較好的抑菌作用，最小抑菌濃度分別為1、0.8、0.2 mg/mL。殼聚糖和單辛酸甘油酯能同時(shí)有效抑制腐敗醬豬肝中的3種污染微生物。

腐敗；醬豬肝；16S rDNA；抑菌；真空包裝

豬肝中含有豐富的鐵元素，營養(yǎng)豐富，深受我國廣大人民的喜愛。醬豬肝是選用豬肝、香辛料，以獨(dú)特工藝制做而成的，是我國傳統(tǒng)的醬鹵肉制品之一。目前市售的醬豬肝大多采用真空包裝延長貨架期，但仍然經(jīng)常發(fā)生“黑肝”的腐敗現(xiàn)象。肉制品生產(chǎn)過程中通常添加防腐劑、采用高溫加熱和真空包裝保證貨架期。真空包裝是我國熟肉制品的重要保藏形式，由于去除了空氣中的氧氣，抑制或減緩了好氣性的微生物生長，減少了肉制品成分的降解和脂肪的氧化酸敗，從而大大延長產(chǎn)品的保質(zhì)期。但是，由于在熟制和加熱殺菌過程中微生物死亡不徹底，真空包裝肉制品中的厭氧微生物特別是梭狀芽孢桿菌、乳酸菌等大量繁殖，常常引起肉制品發(fā)粘、軟化，嚴(yán)重時(shí)會(huì)出現(xiàn)液化、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣和惡臭，導(dǎo)致“脹袋”現(xiàn)象，造成食品安全危害并帶來經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)真空包裝肉制品如對(duì)發(fā)酵灌腸制品和發(fā)酵火腿的研究發(fā)現(xiàn)乳桿菌、片球菌、微球菌等屬是主要污染菌[1]，真空包裝煙熏火腿切片中常見的污染菌有腸膜明串珠菌、彎曲乳酸菌、清酒乳酸菌等[2]，對(duì)真空包裝冷卻豬肉中菌相的變化分析可知，主要污染菌有乳酸菌、漫游球菌、肉食桿菌、乳桿菌、乳球菌和熱死環(huán)絲菌等[3]，真空包裝的玉米腸中含有枯草芽孢桿菌屬等[4]。另外經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，真空包裝肉制品中的污染微生物主要還包括乳酸乳桿菌、彎曲乳桿菌、米酒乳桿菌以及腸桿菌等[5]。有些生產(chǎn)廠家真空包裝不嚴(yán)密，導(dǎo)致肉制品中一些好氧和兼性的微生物生長繁殖，如芽孢桿菌、腸球菌、葡萄球菌、微球菌屬、乳桿菌屬等[6-7]。目前的很多研究只是從腐敗的肉樣中分離出污染微生物，通過傳統(tǒng)的生理生化分離鑒定微生物，但往往鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確。另外還有研究采用16S rDNA變性膠凝膠電泳（DGGE）分析鑒定肉制品在貯藏過程中腐敗菌相的變化情況[2-3]，意大利學(xué)者通過PCRDGGE的方法從天然的意大利發(fā)酵香腸中鑒定出微球菌、乳酸菌、木糖葡萄球菌、腸桿菌和糞便腸球菌等[8]。國內(nèi)的學(xué)者利用DGGE的方法分析了真空包裝冷卻豬肉中的菌相變化情況[3]。盡管利用DGGE的方法可以將真空包裝肉制品中存在的所有腐敗微生物都鑒定出來，并能反映出微生物在肉制品的貯藏過程中的動(dòng)態(tài)變化情況，但可能會(huì)將肉制品中已死亡的微生物鑒定出來，造成對(duì)肉制品污染微生物的誤檢。對(duì)污染肉制品中的污染微生物利用16S rDNA序列分析的方法鑒定的研究也有報(bào)道，韓國學(xué)者從發(fā)酵的海產(chǎn)品中采用16S rDNA序列分析的方法鑒定了污染微生物，結(jié)果表明發(fā)酵的海鮮中主要的微生物為葡萄球菌屬、桿菌屬和鹽單胞菌屬等[9]。國內(nèi)學(xué)者利用該方法鑒定了真空包裝玉米腸中的致腐微生物，結(jié)果表明玉米腸中的致腐微生物為芽孢桿菌屬[10]。由此可見，已有的真空包裝肉制品污染微生物的報(bào)道較多的集中在火腿腸等產(chǎn)品上，關(guān)于醬豬肝“黑肝”的污染微生物的分離鑒定以及防腐研究尚鮮見報(bào)道。本研究對(duì)腐敗醬豬肝中的污染微生物進(jìn)行分離，并通過16S rDNA序列分析鑒定，對(duì)鑒定的污染微生物進(jìn)行防腐劑抑菌作用研究，為真空包裝醬豬肝腐敗的原因分析及防腐研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

真空包裝醬豬肝污染樣品：北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司鵬程食品分公司；Nisin：浙江銀象生物工程有限公司；脫氫醋酸鈉：重慶威迪食品科技有限公司；聚賴氨酸：蘭州偉日生物工程有限公司；殼聚糖：山東萊州市海力生物制品有限公司；單辛酸甘油酯：杭州萬景新材料有限公司；D-異抗壞血酸：江西百勤集團(tuán)異VC鈉有限公司。

強(qiáng)化梭狀芽孢桿菌培養(yǎng)基（RCM）：牛肉浸膏10.0g，酵母浸膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，D-葡萄糖5.0 g，水合乙酸鈉5.0 g，鹽酸-L-半胱氨酸0.5 g，可溶性淀粉1.0 g，刃天青（0.2%）1 mL～2 mL，蒸餾水 1000 mL，瓊脂 20 g，pH 7.0～7.2，115℃濕熱滅菌15 min。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）：牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1000 mL，pH 7.0～7.2，121℃濕熱滅菌20 min。實(shí)驗(yàn)所用藥品和試劑均為分析純。

結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（VRBGA）：蛋白胨7.0 g，酵母粉3.0 g，氯化鈉5.0 g，葡萄糖10.0 g，膽鹽 1.5 g，結(jié)晶紫 0.002 g，中性紅 0.03 g，瓊脂 15.0 g，乳糖 10.0 g，pH 7.4±0.2。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；UV-2000紫外可見分光光度計(jì)：尤尼柯上海儀器有限公司；Mini-Protean Tetra Cell電泳儀、96-well Thermal cycler PCR儀：美國伯樂公司；DPX-9082 B-2電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；YX-280D高壓滅菌鍋：合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；BSA2202SCW電子天平：北京Sartorius儀器系統(tǒng)有限公司；YS-100光學(xué)顯微鏡：Nikon；YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；Eppendorf Research單道可調(diào)量程移液器：德國艾本德股份公司生產(chǎn)；柱式DNA膠回收試劑盒：北京天恩澤基因科技有限公司；凝膠成像儀ChampGel-3200：北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.3 腐敗的樣品中微生物的分離純化

腐敗的真空包裝醬豬肝從生產(chǎn)廠家收集后，用冰袋保存送至實(shí)驗(yàn)室，立刻放入4℃的冰箱中保藏。實(shí)驗(yàn)時(shí)，無菌操作取腐敗樣品5 g，用無菌剪刀剪碎，放入裝有30 mL無菌的鹽蛋白胨水（0.85%氯化鈉，0.1%蛋白胨）的三角瓶中，封口后置于搖床上震搖30 min，然后取1 mL懸浮液加入9 mL無菌的蛋白胨水中，依次進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇3個(gè)合適的梯度，取0.1 mL涂于上述3種培養(yǎng)基上。每個(gè)稀釋度做兩個(gè)重復(fù)，放入恒溫培養(yǎng)箱中30℃進(jìn)行好氧培養(yǎng)，對(duì)厭氧菌利用厭氧培養(yǎng)箱在30℃進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為2 d[11-12]，計(jì)算腐敗醬豬肝中的菌落數(shù)量。經(jīng)培養(yǎng)后，從上述培養(yǎng)基的平板上挑取各種典型生長的菌落，在各自的培養(yǎng)平板上反復(fù)的劃線進(jìn)行分離、純化（＞3次），得到純化的單菌落[2，11]。厭氧微生物取單菌落進(jìn)行半固體穿刺培養(yǎng)、保存，而好氧微生物取單菌落接種斜面培養(yǎng)、保存。對(duì)所分離出的微生物進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，革蘭氏染色法觀察細(xì)胞形態(tài)[13]，再采用16Sr DNA基因序列分析的方法鑒定。

1.4 菌種鑒定

1.4.1 細(xì)菌總DNA的提取

將菌種液體培養(yǎng)過夜，細(xì)菌收集：取1 mL培養(yǎng)物于1.5mLEppendorf管中，室溫10000r/min離心5min，棄上清，沉淀重新懸浮于1 mL TE（Tris-HCl和EDTA的混合液）（pH 8.0）中（用ddH2O也行，可多次離心以收集更多的菌體)。菌體裂解：加入6 μL 50 mg/mL的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μL，10%SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）110 μL，50℃作用 3h或 37℃過夜。抽提：菌液均分到兩個(gè)1.5 mL Eppendorf管，加等體積的酚:氯仿:異戊醇（25:24:1），混勻，室溫放置5 min～10 min。14000 r/min離心10 min。抽提兩次。加入等體積的氯仿，輕輕混合，12000r/min4℃離心3min。上清吸入另一干燥離心管中。沉淀：加入1/10體積的醋酸鈉（10 mmol/L）溶液，混勻，加0.6倍體積冷的異丙醇，混勻，-20℃放置1h或過夜，12000r/min離心10min。洗滌：沉淀用75%的乙醇洗滌兩次，真空干燥，直至無乙醇味（離心用的轉(zhuǎn)速為14000 r/min離心10 min）。抽（涼）干后，溶于 40 μL～50 μL TE（Tris-HCl和 EDTA的混合液）或ddH2O中，取5 μL電泳，剩余作PCR（Polymerase Chain Reaction）模板用[2，12]。

1.4.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

PCR反應(yīng)中所用引物分別為上游引物P50157：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游引物P50158：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'，擴(kuò)增細(xì)菌 16S rDNA基因序列。PCR 25 μL反應(yīng)體系包含：1 μL模板DNA，引物各 2.5 μL（2 μmol/L），15.7μL 雙蒸水，2.5 μL 10×buffer，0.5 μL dNTP（10 mmol/L），0.3 μL Taq 酶（5 U）。采用的PCR程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性40 s，50℃退火30 s，72℃延伸2 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測后于4℃保存?zhèn)溆肹2，14-15]。

1.4.3 DNA回收

根據(jù)北京天恩澤基因科技有限公司生產(chǎn)的柱式DNA膠回收試劑盒的說明書，將已擴(kuò)增的16S rDNA基因序列進(jìn)行切膠回收。

1.4.4 PCR產(chǎn)物測序及分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。登錄NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/），將所得序列與數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行相似性比對(duì)[3，16]。

1.5 單一防腐劑對(duì)醬豬肝中微生物的抑菌效果研究

將各種防腐劑通過單一抑菌實(shí)驗(yàn)測試對(duì)污染菌的抑菌效果，每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行。選擇出對(duì)腐敗醬豬肝中的微生物抑菌效果較好的防腐劑，再用濁度法進(jìn)行各防腐劑的抑菌效果研究。對(duì)Nisin、脫氫醋酸鈉、EDTA二鈉、聚賴氨酸、D-異抗壞血酸、殼聚糖和單辛酸甘油酯按照國標(biāo)中規(guī)定的最大使用量設(shè)定一定范圍的濃度，用濁度法測定它們對(duì)醬豬肝中微生物的抑菌效果。將液體培養(yǎng)基、菌液和防腐劑溶液按照一定的比例混合，進(jìn)行單一防腐劑抑菌效果的研究。各防腐劑的抑菌率計(jì)算如下式：

式中：ODn為未加防腐劑的試管的吸光值；ODi為加有防腐劑的試管的吸光值。

2 結(jié)果和分析

2.1 腐敗醬豬肝中微生物的分離與初步鑒定

醬豬肝的腐敗現(xiàn)象為肉體發(fā)黑、袋內(nèi)有黏液。根據(jù)資料記載，肉制品中的腐敗微生物主要有梭狀芽孢桿菌、腸道菌和環(huán)境中的污染微生物，適合于這幾類微生物生長的培養(yǎng)基，主要有RCM培養(yǎng)基、VRBGA培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基。利用這3種培養(yǎng)基對(duì)腐敗醬豬肝中微生物進(jìn)行稀釋倒平板法分離培養(yǎng)并計(jì)數(shù)，結(jié)果如表1所示。

表1 腐敗醬豬肝中微生物的培養(yǎng)計(jì)數(shù)Table 1 Colony enumeration of microorganisms from spoilage sauced pork liver in three different culture medium cfu/g

VRBGA平板上生長的細(xì)菌總數(shù)達(dá)到最大，表明VRBGA最適合于分離醬豬肝中的污染微生物，從3種培養(yǎng)基中共分離出3種不同菌落形態(tài)和菌體形態(tài)的細(xì)菌，一種為球菌，G+；兩種為桿菌，G-。腐敗醬豬肝樣品如圖1所示，光學(xué)顯微鏡下的菌體形態(tài)如圖2所示。

圖1 腐敗的醬豬肝Fig.1 The septic sauced pork liver

圖2 光學(xué)顯微鏡下的菌體形態(tài)Fig.2 The morphology of strains under optical microscope

2.2 污染微生物的16S rDNA鑒定結(jié)果

將分離到的3種不同微生物提取總DNA，并進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增，回收擴(kuò)增條帶，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，將所測16S rDNA序列登錄NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）進(jìn)行相似性比對(duì)，結(jié)果如表2所示。

表2 細(xì)菌菌種鑒定信息Table 2 The information of identified spoilage microorganisms

從醬豬肝中分離出的微生物的特性如下：血居吸蟲腸球菌屬于腸球菌屬，在平板上的單菌落形態(tài)為邊緣整齊，表面形態(tài)為圓形，菌落扁平，乳白色，顯微鏡下形態(tài)為球狀，細(xì)胞外圍有粘液，革蘭氏陽性。普通變形桿菌屬于變形桿菌屬，在平板上的單菌落形態(tài)為邊緣整齊，圓形，菌落扁平，乳白色，可運(yùn)動(dòng)，顯微鏡下形態(tài)為長桿狀，革蘭氏陰性。豬糞便細(xì)菌屬于變形桿菌屬，在平板上的單菌落形態(tài)為邊緣絲狀，表面形態(tài)為油煎蛋形，菌落扁平，乳白色，有鞭毛，可運(yùn)動(dòng)，顯微鏡下形態(tài)為長桿狀，革蘭氏陰性。這3種污染微生物都屬于腸道菌，它們?cè)诟瘮♂u豬肝中的存在說明豬肝原料本身所攜帶的污染微生物是真空包裝醬豬肝污染的主要原因之一，因此，保證肉類原料在屠宰過程中的衛(wèi)生條件是保障肉制品防腐的重要前提。

2.3 單一防腐劑對(duì)醬豬肝中腐敗菌的抑菌效果

醬豬肝污染微生物防腐研究材料的選擇基于以下3點(diǎn)：①選用可以在肉制品中使用的防腐劑，如乳酸鏈球菌素、脫氫醋酸鈉，山梨酸鉀等防腐劑由于在我們以往的實(shí)驗(yàn)中使用效果不理想，此次實(shí)驗(yàn)未列入；②可以在肉制品中使用的具有抑菌作用的非防腐劑類物質(zhì)，如乳化劑單辛酸甘油酯，抗氧化劑異VC酸，另外還有殼聚糖等；③目前還未批準(zhǔn)但將來可能批準(zhǔn)使用的新型防腐劑，如聚賴氨酸。這些物質(zhì)的抑菌作用研究結(jié)果將會(huì)為醬豬肝的防腐研究提供參考。

2.3.1 Nisin對(duì)腐敗菌的抑菌效果

Nisin對(duì)腐敗菌的抑菌效果見圖3。

圖3 不同濃度的Nisin對(duì)測試菌的抑菌效果Fig.3 Antimicrobial effect of Nisin at various concentration on tested bacteria

由圖3中的A和B圖可知，在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，隨著Nisin濃度的增加它對(duì)血居吸蟲腸球菌的抑菌效果逐漸增強(qiáng)，Nisin對(duì)血居吸蟲腸球菌的最小抑菌濃度為0.1 mg/mL。Nisin對(duì)普通變形桿菌的抑菌效果較差，當(dāng)濃度為1 mg/mL時(shí)，抑菌率僅為15%。對(duì)豬糞便細(xì)菌，Nisin在10 mg/mL僅有部分抑菌效果（數(shù)據(jù)未顯示），考慮到Nisin有苦味，價(jià)格高，添加量太大影響醬豬肝的風(fēng)味和增加成本，因此沒有測定它的最小抑菌濃度。結(jié)果表明，Nisin對(duì)血居吸蟲腸球菌的抑菌效果好，而對(duì)其他兩株菌的抑菌效果較差。

2.3.2 脫氫醋酸鈉對(duì)腐敗菌的抑菌效果

脫氫醋酸鈉對(duì)腐敗菌的抑菌效果見圖4。

圖4 不同濃度的脫氫醋酸鈉對(duì)測試菌的抑菌效果Fig.4 Antimicrobial effect of sodium dehydroacetate at various concentration on tested bacteria

由圖4中的A圖可知，在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)脫氫醋酸鈉對(duì)普通變形桿菌和豬糞便細(xì)菌的抑菌效果隨著防腐劑濃度的增加而增加，對(duì)這兩株菌的最小抑菌濃度分別為0.6 mg/mL和1 mg/mL，當(dāng)脫氫醋酸鈉的濃度大于0.4 mg/mL時(shí)，對(duì)豬糞便細(xì)菌的抑菌效果顯著增強(qiáng)。由圖B可知，脫氫醋酸鈉對(duì)豬糞便細(xì)菌的最小抑菌濃度為6 mg/mL。

2.3.3 聚賴氨酸對(duì)腐敗菌的抑菌效果

聚賴氨酸對(duì)腐敗菌的抑菌效果見圖5?？芍?，聚賴氨酸對(duì)血居吸蟲腸球菌、普通變形桿菌和豬糞便細(xì)菌的最小抑菌濃度分別為0.2、10、2 mg/mL，當(dāng)聚賴氨酸的濃度在0.2mg/mL～0.8mg/mL時(shí)，對(duì)豬糞便細(xì)菌的抑菌率緩慢增加，而當(dāng)濃度在0.8 mg/mL～1.2 mg/mL時(shí)，對(duì)豬糞便細(xì)菌的抑菌率迅速增加。

圖5 不同濃度的聚賴氨酸對(duì)測試菌的抑菌效果Fig.5 Antimicrobial effect of polylysine at various concentration on tested bacteria

2.3.4 D-異抗壞血酸對(duì)腐敗菌的抑菌效果

D-異抗壞血酸對(duì)腐敗菌的抑菌效果見圖6。可知D-異抗壞血酸對(duì)普通變形桿菌的最小抑菌濃度為0.6 mg/mL，而對(duì)血居吸蟲腸球菌（數(shù)據(jù)未顯示）和豬糞便細(xì)菌在濃度為10 mg/mL時(shí)才有抑菌效果，在1mg/mL時(shí)抑菌效果較差。另外隨著D-異抗壞血酸濃度的增加其抑菌效果也逐漸增強(qiáng)。由于考慮到D-異抗壞血酸在實(shí)際應(yīng)用中的添加量，因此沒有再測它對(duì)血居吸蟲腸球菌和豬糞便細(xì)菌的最小抑菌濃度。

圖6 不同濃度的D-異抗壞血酸對(duì)污染菌的抑菌效果Fig.6 Antimicrobial effect of D-isoascorbic acid at various concentration on tested bacteria

2.3.5 殼聚糖對(duì)腐敗菌的抑菌效果

殼聚糖對(duì)腐敗菌的抑菌效果見圖7。

圖7 不同濃度的殼聚糖對(duì)測試菌的抑菌效果Fig.7 Antimicrobial effect of chitosan at various concentration on tested bacteria

由圖7可知，殼聚糖對(duì)血居吸蟲腸球菌、普通變形桿菌和豬糞便細(xì)菌的最小抑菌濃度均為0.2 mg/mL。當(dāng)殼聚糖濃度在0.02 mg/mL～0.08 mg/mL時(shí)，對(duì)血居吸蟲腸球菌和豬糞便細(xì)菌的抑菌效果優(yōu)于對(duì)普通變形桿菌的抑菌效果。

2.3.6 單辛酸甘油酯對(duì)腐敗菌的抑菌效果

單辛酸甘油酯對(duì)腐敗菌的抑菌效果見圖8?？芍瑔涡了岣视王?duì)血居吸蟲腸球菌、普通變形桿菌和豬糞便細(xì)菌的最小抑菌濃度分別為0.4、0.4、0.8 mg/mL。由圖A可知，當(dāng)單辛酸甘油酯的濃度小于0.02 mg/mL，隨著防腐劑濃度的增加，抑菌率上升很快，當(dāng)單辛酸甘油酯的濃度在0.02 mg/mL～0.2 mg/mL時(shí)，抑菌率增加緩慢，而當(dāng)單辛酸甘油酯的濃度大于0.2 mg/mL時(shí)，抑菌率又呈較快上升趨勢(shì)。

圖8 不同濃度的單辛酸甘油酯對(duì)污染菌的抑菌效果Fig.8 Antimicrobial effect of glycerol monocaprylate at various concentration on tested bacteria

通過單一防腐劑的抑菌實(shí)驗(yàn)得到以下結(jié)果。對(duì)血居吸蟲腸球菌抑菌效果好的防腐劑為Nisin、聚賴氨酸、單辛酸甘油酯和殼聚糖。對(duì)普通變形桿菌抑菌效果好的防腐劑為脫氫醋酸鈉、單辛酸甘油酯、D-異抗壞血酸和殼聚糖。對(duì)豬糞便細(xì)菌抑菌效果好的防腐劑為脫氫醋酸鈉、單辛酸甘油酯和殼聚糖。

3 結(jié)論

1.在腐敗的醬豬肝中，從RCM、VRBGA和NA培養(yǎng)基中分離到3種污染微生物，其中VRBGA為最適培養(yǎng)基。經(jīng)形態(tài)觀察、革蘭氏染色和16S rDNA鑒定，3種污染微生物分別為：球菌為血居吸蟲腸球菌，G+；兩種桿菌分別為普通變形桿菌和豬糞便細(xì)菌，G-。

2.單一防腐劑的抑菌研究結(jié)果表明：對(duì)血居吸蟲腸球菌，Nisin、聚賴氨酸、單辛酸甘油酯和殼聚糖的最小抑菌濃度分別為 0.1、0.2、0.4、0.2 mg/mL；對(duì)普通變形桿菌，脫氫醋酸鈉、單辛酸甘油酯、D-異抗壞血酸和殼聚糖的最小抑菌濃度分別為0.6、0.4、0.6、0.2 mg/mL；對(duì)豬糞便細(xì)菌，脫氫醋酸鈉、單辛酸甘油酯和殼聚糖的最小抑菌濃度分別為1、0.8、0.2 mg/mL。

3.Nisin對(duì)革蘭氏陽性菌的抑菌效果好，而對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌效果較差，這與以前的報(bào)道一致[17]。單一防腐劑中殼聚糖和單辛酸甘油酯能有效抑制腐敗醬豬肝中的3種污染微生物，可望用于醬豬肝的防腐中。

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Isolation and Identification of Spoilage Microorganisms in Vacuum-packaged Sauced Pork Liver and the Antimicrobial Study

MA Han-xiao1，LI Chun1,2，ZHOU Xiao-hong2,*

（1.School of Chemistry and Chemical Engineering,Shihezi University,Shihezi 832003,Xinjiang,China;2.School of Life Science,Beijing Institute of Technology,Beijing 100081,China）

Spoilage microorganisms from septic sauced pork liver were isolated,and three different contaminated microorganisms were obtained.The optimal medium crystal violet neutral red bile glucose agar VRBGA was selected.The three strains,one strain of coccus was identified to be Enterococcus sanquinicola,and two strains of bacillus were Proteus vulgaris and Swine manure bacterium,respectively,by method of 16S rDNA analysis.Antimicrobial study of single preservative for contaminated microorganisms showed that Nisin,polylysine,glycerol monocaprylate and chitosan possessed high antimicrobial effect for Enterococcus sanquinicola,the minimum inhibitory concentration was 0.1,0.2,0.4 and 0.2 mg/mL,respectively.Sodium dehydroacetate,glycerol monocaprylate,D-isoascorbic acid and chitosan had high antimicrobial effect for Proteus vulgaris,the minimum inhibitory concentration was 0.8,0.4,0.6 and 0.2 mg/mL,respectively.Sodium dehydroacetate,glycerol monocaprylate and chitosan possessed high antimicrobial effect for Swine manure bacterium,the minimum inhibitory concentration was 1,0.8 and 0.2 mg/mL,respectively.Preservatives that have high antimicrobial effect simultaneously for three strains were chitosan and glycerol monocaprylate.

spoilage;sauced pork liver;16S rDNA;antimicrobial;vacuum-packaged

*通信作者：周曉宏（1965—），男（漢），副教授，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目“食品添加劑制造關(guān)鍵技術(shù)研究”（2011BAD23B01）；“1萬噸/年富含蛋白質(zhì)發(fā)酵殘?jiān)咧祷眉夹g(shù)及示范”（2011BAC11B06）

馬含笑（1983—），女（漢），碩士研究生，研究方向：生物制品與生化工程。

2011-12-27