張慧，李媛，徐倩文，陳芳

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院；果蔬加工教育部工程研究中心；農(nóng)業(yè)部果蔬加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

黃芩莖葉中活性成分野黃芩苷的微波提取工藝

張慧，李媛，徐倩文，陳芳*

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院；果蔬加工教育部工程研究中心；農(nóng)業(yè)部果蔬加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

對(duì)微波法提取黃芩莖葉中主要活性成分野黃芩苷的工藝進(jìn)行了研究，探討目數(shù)、料液比、乙醇濃度、提取功率、提取時(shí)間各因素對(duì)提取率的影響。采用響應(yīng)面分析法（response surface method，RSM）確定了微波提取的最佳工藝。結(jié)果顯示，當(dāng)乙醇濃度為40%，提取時(shí)間2.58 min，提取功率500 W時(shí)，野黃芩苷的提取率可以達(dá)到5.35%，并且該工藝有很好的重現(xiàn)性。

黃芩莖葉；野黃芩苷；微波提取；響應(yīng)面法

黃芩為唇形科多年生草本植物黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根[1]，目前主要以其根作為傳統(tǒng)藥用，而產(chǎn)量數(shù)倍于根的莖葉部分被大量廢棄，造成藥用資源的浪費(fèi)。有研究表明，黃芩莖葉中含有豐富的黃酮類化合物，具有較強(qiáng)的抗炎、抗氧化、抗缺氧、和記憶改善作用[2-4]。野黃芩苷為其中含量最豐富的黃酮化合物單體，而目前關(guān)于野黃芩苷的提取主要是采用中藥半枝蓮和燈盞細(xì)辛作為原料[5-7]。本文以黃芩莖葉作為提取原料，采用微波輔助提取工藝，通過(guò)響應(yīng)面分析法得到最優(yōu)提取參數(shù)，在此條件下得到較高野黃芩苷提取率，對(duì)于充分的利用中藥資源，擴(kuò)充黃酮類化合物的來(lái)源有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃芩莖葉：大興安嶺林格貝有機(jī)食品有限責(zé)任公司；野黃芩苷對(duì)照品（>95%）：上海同田生物技術(shù)有限公司；色譜乙腈：美國(guó)Honeywell公司；色譜甲酸：德國(guó)Sigma-Aldrich公司；分析純乙醇：北京化學(xué)試劑有限公司。

MAS-Ⅱ型常壓微波合成/萃取反應(yīng)工作站：上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；Waters 2695 HPLC色譜儀：美國(guó)；SHB型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州市上街華科儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃芩莖葉中野黃芩苷含量的測(cè)定

1.2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取野黃芩苷對(duì)照品（>95%）10.00mg于10mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容搖勻，得到濃度為1 mg/mL的野黃芩苷對(duì)照品溶液。

1.2.1.2 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm；5.0 μm）；柱溫 30 ℃；流速 0.8 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為335 nm；流動(dòng)相A為0.5%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈；洗脫程序：0～5 min（B：20%）；5 min～10 min（B：20→25%）；10 min～12 min（B：25→30%）；12min～15min （B：30→50%）；15min～17min（B：50→30%）；17min～18min（B：30→20%）；18min～20min（B：20%）。

1.2.1.3 野黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取適量野黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液，加入適量50%乙醇溶液，配制成濃度為 2.5、5、10、20、25、50 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。得到回歸方程Y=150.63X-364.48，R2=0.9992，表明野黃芩苷在2.5μg/mL～50μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 原料目數(shù)對(duì)野黃芩苷提取率的影響

原料經(jīng)粉粹過(guò)篩，得到0～40目、40目～80目、80目～120目及120目以上的不同目數(shù)原料顆粒，精確稱取上述原料各1.000 g，加入50 mL提取溶劑50%乙醇水溶液，于提取功率400 W提取1 min。樣品經(jīng)抽濾后定容至50 mL，測(cè)定提取液中野黃芩苷含量。

1.2.2.2 乙醇濃度對(duì)野黃芩苷提取率的影響

精確稱取黃芩莖葉粉末樣品（80目～120目）1.000g，分別添加30%、50%、70%、95%的乙醇水溶液50 mL，于提取功率400 W提取1 min。樣品經(jīng)抽濾后定容至50 mL，測(cè)定提取液中野黃芩苷含量。

1.2.2.3 料液比對(duì)野黃芩苷提取率的影響

精確稱取黃芩莖葉粉末樣品（80目～120目）1.000g，分別添加 50%乙醇水溶液 10、20、30、40、50 mL，于400、700 W分別提取5 min，樣品經(jīng)抽濾后定容，測(cè)定提取液中野黃芩苷含量。

1.2.2.4 提取功率對(duì)野黃芩苷提取率的影響

精確稱取黃芩莖葉粉末樣品（80目～120目）1.000g，分別添加50%乙醇水溶液50 mL，于提取功率300 W～700W分別提取1、3、5min，樣品經(jīng)抽濾后定容至50mL，測(cè)定提取液中野黃芩苷含量。

1.2.2.5 提取時(shí)間對(duì)野黃芩苷提取率的影響

精確稱取黃芩莖葉粉末樣品（80目～120目）1.000g，添加50%乙醇水溶液50mL，分別于300、500、700W下提取 1、2、3、4、5、6、7 min，樣品經(jīng)抽濾后定容至 50 mL，測(cè)定提取液中野黃芩苷含量。

1.2.3 響應(yīng)面法對(duì)野黃芩苷提取條件進(jìn)行優(yōu)化

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面法在三因素三水平上對(duì)黃芩莖葉中野黃芩苷的提取條件進(jìn)行優(yōu)化[8]。試驗(yàn)因子和水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用Origin 8.0；響應(yīng)面分析采用Design-Expert 8.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)各個(gè)因素對(duì)提取率的影響

2.1.1 原料目數(shù)對(duì)黃芩莖葉中野黃芩苷提取率的影響原料目數(shù)對(duì)黃芩莖葉中野黃芩苷提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同目數(shù)對(duì)野黃芩苷提取率的影響Fig.1 Effects of different meshes of raw material on yield of scutellarin

原料目數(shù)不同，即原料與提取溶劑接觸面積不同，將直接影響到提取效果。結(jié)果表明，隨著目數(shù)的增加，野黃芩苷的提取率明顯增加，這是因?yàn)轭w粒越小，越有利于傳質(zhì)，有效成分越容易溶出，提取率自然會(huì)增加。但考慮到原料目數(shù)越大，粉碎成本越高，且不利于后續(xù)的純化，綜合考慮，我們最終選定原料的目數(shù)范圍為80目～120目。

2.1.2 乙醇濃度對(duì)黃芩莖葉中野黃芩苷提取率的影響

乙醇濃度對(duì)黃芩莖葉中野黃芩苷提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同乙醇濃度對(duì)野黃芩苷提取率的影響Fig.2 Effects of different ethanol concentration on yield of scutellarin

黃酮類物質(zhì)易溶于有機(jī)溶劑，考慮到乙醇的無(wú)毒性，試驗(yàn)均以乙醇為提取溶劑。結(jié)果表明，隨著乙醇濃度的升高，野黃芩苷提取率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到95%時(shí)，野黃芩苷提取率顯著降低，一方面可能是因?yàn)殡S乙醇-水體積分?jǐn)?shù)的變化，溶劑的極性大小隨之變化，對(duì)不同成分的溶出發(fā)生變化，另一方面可能是因?yàn)楦邼舛纫掖际辜?xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性凝固，黃酮不易溶出；觀察提取液外觀顏色可以看出，隨著乙醇濃度增加，提取液顏色逐漸由黃褐色轉(zhuǎn)變成鮮艷綠色，說(shuō)明脂溶性葉綠素漸漸被提取出，這對(duì)后續(xù)純化帶來(lái)了一定的不便。最后確定50%乙醇為最佳提取溶劑濃度。

2.1.3 料液比對(duì)黃芩莖葉野黃芩苷提取率的影響

料液比對(duì)黃芩莖葉野黃芩苷提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不同料液比對(duì)野黃芩苷提取量的影響Fig.3 The effects of solid to liquid ratio on yield of scutellarin

由圖3可知，隨著料液比的增加提取率隨之增加，于 1:50（g/L）達(dá)到最大值，這是因?yàn)?，通常情況下，當(dāng)樣品量一定，增加溶劑的量可以降低藥材顆粒周圍的濃度，使細(xì)胞壁內(nèi)外兩側(cè)的濃度差增大，從而加速有效成分的擴(kuò)散，有利于成分的溶出。由于料液比過(guò)大不利于后續(xù)的分離純化，我們沒(méi)有再進(jìn)行更大料液比的試驗(yàn)。最后選定料液比 1:50（g/L）。

2.1.4 提取功率對(duì)黃芩莖葉中野黃芩苷提取率的影響提取功率對(duì)黃芩莖葉中野黃芩苷提取量的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 提取功率對(duì)野黃芩苷提取率的影響Fig.4 The effect of irradiation power on yield of scutellarin

隨著功率的增加，提取量達(dá)到最大值所需時(shí)間逐漸減小，當(dāng)提取功率較低時(shí)（300 W），5 min的提取量顯著高于1 min，而當(dāng)提取功率增大到700 W時(shí)，3 min與5 min的野黃芩苷提取量基本相同。統(tǒng)計(jì)分析表明：提取時(shí)間為1 min時(shí)，300 W與400 W差異不顯著，500 W分別與400 W、600 W差異不顯著，600 W與700 W差異不顯著（p>0.05），其余處理之間差異顯著；提取時(shí)間為3 min時(shí)，500 W分別與300 W、400 W、600 W差異顯著（p<0.05），其余處理之間差異不顯著；提取時(shí)間為5min時(shí)，300W與700W，400W與500W、600 W之間差異不顯著（p>0.05），其余其余處理之間差異顯著。

2.1.5 提取時(shí)間對(duì)黃芩莖葉中野黃芩苷提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)黃芩莖葉中野黃芩苷提取率的影響結(jié)果如圖5所示。

圖5 提取時(shí)間對(duì)野黃芩苷提取量的影響Fig.5 The effect of extraction time on yield of scutellarin

隨著提取功率的增加，野黃芩苷提取率達(dá)到最大飽和值所需時(shí)間均逐漸減小，當(dāng)提取功率為300 W時(shí)，提取率于5 min達(dá)到最大值；當(dāng)提取功率為500 W時(shí)，提取率在3 min達(dá)到最大值；當(dāng)提取功率為700 W時(shí)，提取率在2 min達(dá)到最大值。統(tǒng)計(jì)分析表明：提取功率為300 W時(shí)，1 min與各處理差異顯著（p<0.05），2 min與5 min差異顯著（p<0.05），其余各處理差異不顯著（p>0.05）；提取功率為500 W時(shí)，1 min與各處理時(shí)間差異顯著（p<0.05），其余各處理差異不顯著（p>0.05）；提取功率為700 W時(shí)，1 min與7 min與其他各處理均差異顯著（p<0.05），其余各處理時(shí)間差異不顯著（p>0.05）。

2.2 響應(yīng)面分析法對(duì)野黃芩苷提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

通過(guò)上面單因素影響條件的研究，確定了最佳的試驗(yàn)條件范圍，根據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取微波提取時(shí)間（A）,提取功率（B）以及乙醇濃度（C）為變量，野黃芩苷提取率（Y1）為響應(yīng)值。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experiment design and results of response surface method

利用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行回歸分析，各因素經(jīng)回歸擬合后，得到提取時(shí)間、提取功率、乙醇濃度對(duì)微波提取量的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y1=5.19+0.17A-0.028B-0.15C-0.19AB-0.044AC+6.25×10-3BC-0.25A2-0.23B2-0.057C2

對(duì)模型進(jìn)行顯著性分析可知，模型的P值分別為0.0418，小于0.05，表明模型顯著。失擬項(xiàng)p=0.0854＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，表明方程對(duì)試驗(yàn)擬合程度好。試驗(yàn)因素一次項(xiàng)（A、C）、二次項(xiàng)（AB、A2、B2）對(duì)結(jié)果影響顯著（p＜0.05），交互項(xiàng)（AC、BC）對(duì)結(jié)果影響不顯著（p＞0.05）。在所選的因素水平范圍內(nèi)，各因素對(duì)結(jié)果的影響排序?yàn)椋禾崛r(shí)間（A）＞乙醇濃度（C）＞提取功率（B）。根據(jù)回歸方程作出響應(yīng)面分析見(jiàn)圖6。

圖6 響應(yīng)面法（時(shí)間，功率）立體分析圖Fig.6 The analytical graph of response surface of the effect of powder and time

2.2.2 優(yōu)化驗(yàn)證

通過(guò)Design Expert 8.0軟件進(jìn)行優(yōu)化，得到優(yōu)化的結(jié)果為提取時(shí)間2.59 min，功率470.93 W，乙醇濃度40%，在此條件下野黃芩苷提取率可達(dá)到5.34%。由于實(shí)驗(yàn)操作的可行性，將微波萃取的最佳條件修正為：提取時(shí)間2.6 min，提取功率500 W，乙醇濃度40%，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證性度驗(yàn)，測(cè)得野黃芩苷提取率為5.35%，與理論預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差很小，說(shuō)明該模型能很好的預(yù)測(cè)各因素與提取量之間的關(guān)系。

3 結(jié)論

應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化微波提取黃芩莖葉野黃芩苷的工藝，得到最佳工藝為：微波提取時(shí)間2.6 min，功率500 W,乙醇濃度40%。在次條件下，野黃芩苷提取率達(dá)到5.35%。該結(jié)果重復(fù)性強(qiáng)，具有重要的研究意義。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:一部[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:211

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Study on the Microwave Assisted Extraction of Active Component of Scutellarin from Stems and Leaves of Scutellaria

ZHANG Hui,LI Yuan,XU Qian-wen,CHEN Fang*
（College of Food Science&Nutritional Engineering,China Agricultural University;Key Laboratory of Fruits Vegetables Processing;Engineering Research Center of Fruits&Vegetables Processing,Beijing 100083,China）

Study on the microwave assisted extraction of scutellarin from stems and leaves of scutellaria.Analyse the mesh,material liquid ratio,ethanol concentration and extracting power,extracting time for the influence of the extraction amount.Using the response surface method(RSM)to determine the best technology of microwave extraction.The results showed that when ethanol concentration was 40%,extracting time 2.58 min,extracting power 500 W,scutellarin can be achieved 5.35%.This process had very good reproducibility.

stems and leaves of scutellaria;scutellarin;microwave extraction;response surface method

北京市科技計(jì)劃課題（D101105046610001）

張慧（1984—），女（漢），在讀研究生，研究方向：天然產(chǎn)物提取。

*通信作者：陳芳，副教授。

2012-03-17