樸春姬 孫曉玲 劉麗波 李林芳 劉 輝 張海英

(吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院放射損傷教研室，吉林 長(zhǎng)春 130021)

攜帶人TRAIL基因的雙靶向溶瘤腺病毒與X線聯(lián)合抑瘤效應(yīng)

樸春姬 孫曉玲 劉麗波 李林芳1劉 輝1張海英

(吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院放射損傷教研室，吉林 長(zhǎng)春 130021)

目的 探討攜帶人TRAIL基因的溶瘤腺病毒CNHK500-hTRAIL，聯(lián)合X線照射對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。方法 將質(zhì)粒pPE3-hTRAIL與pSG500用Lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞內(nèi)同源重組，包裝出的溶瘤腺病毒CNHK500-hTRAIL，采用PCR法進(jìn)行鑒定，并在293細(xì)胞中大量擴(kuò)增病毒，采用50%組織培養(yǎng)感染計(jì)量法測(cè)定病毒滴度，以MOI為5的溶瘤腺病毒CNHK500-hTRAIL感染A549細(xì)胞24 h，用RT-PCR法檢測(cè)hTRAIL基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)。用不同MOI值(0.01～40)的CNHK500-hTRAIL感染A549細(xì)胞，感染5 d，通過四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)其對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞存活率，以便確定適宜的感染滴度。用CNHK500-hTRAIL感染A549細(xì)胞，感染后48 h，用不同劑量的X線(1和2 Gy)照射，照射后3 d，通過MTT比色法檢測(cè)CNHK500-hTRAIL聯(lián)合X線照射下A549細(xì)胞的細(xì)胞存活率。結(jié)果 PCR法鑒定表明溶瘤腺病毒CNHK500內(nèi)攜帶hTRAIL基因，制備的CNHK500-hTRAIL病毒滴度為3.25×109PFU/ml，且CNHK500-hTRAIL攜帶的hTRAIL基因在A549細(xì)胞中有效表達(dá)。經(jīng)不同MOI值CNHK500-hTRAIL感染A549細(xì)胞，細(xì)胞存活率為64.26%～96.02%。CNHK500-hTRAIL感染聯(lián)合不同劑量X線照射組細(xì)胞存活率較單純X線照射(1和2 Gy)和單純CNHK500-hTRAIL感染組明顯降低(P＜0.01)，細(xì)胞存活率分別為50.77%和45.56%，增敏效應(yīng)比值(E/O)為1.5和1.6，均大于1.4。結(jié)論 成功構(gòu)建了攜帶hTRAIL基因的溶瘤腺病毒CNHK500-hTRAIL，CNHK500-hTRAIL感染與X射線聯(lián)合照射對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)有協(xié)同抑制作用。

肺癌;溶瘤腺病毒;腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)凋亡配體;放射治療;細(xì)胞存活率

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)作為TNF家族1995年被Wiley等〔1〕發(fā)現(xiàn)以來，諸多研究證實(shí)，具有選擇性誘導(dǎo)腫瘤凋亡作用，從而對(duì)正常細(xì)胞無凋亡誘導(dǎo)作用。目前，已有TRAIL與電離輻射有協(xié)同抗腫瘤作用的報(bào)道〔2〕，但尚無溶瘤腺病毒介導(dǎo)的TRAIL基因與電離輻射聯(lián)合抑瘤作用的報(bào)道。本文旨在探討攜帶TRAIL基因的溶瘤腺病毒CNHK500-hTRAIL聯(lián)合X線照射對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pPE3-hTRAIL和pSG500以及空病毒載體(CNHK500)由上海東方肝膽外科醫(yī)院病毒與基因治療中心協(xié)助構(gòu)建，293細(xì)胞購(gòu)自加拿大Microbix Biosystems公司，A549細(xì)胞由本室保存。病毒DNA提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司，DMEM及 RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)自 GIBCO-BRL公司，Revert AidTM First Strand Cdna Synthesis Kit購(gòu)自Fermentas公司，2×Taq MasterMix購(gòu)自CWBIO公司，四甲基耦氮唑藍(lán)(MTT)及二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Sigma公司。

1.2 病毒的構(gòu)建與鑒定

取已制備的兩株重組病毒毒株(將質(zhì)粒pPE3-hTRAIL與pSG500用Lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞，出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過3次病毒空斑純化，得到)用QIAGEN DNA Blood Mini Kit試劑盒提取病毒DNA。以病毒DNA為模板用擴(kuò)增hTRAIL基因及mcmv啟動(dòng)子基因的兩對(duì)引物做PCR鑒定，經(jīng)鑒定正確的病毒命名為CNHK500-hTRAIL。鑒定CNHK500-hTRAIL病毒的引物序列見表1。

表1 鑒定CNHK500-hTRAIL病毒的引物序列

1.3 病毒的制備

20 ml 10%FBS/DEME培養(yǎng)75 cm2培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)至80% ～90%293細(xì)胞，然后換成2%FBS/DEME 15 ml，去0.5 μl首次擴(kuò)增的病毒保存液(病毒空斑感染24孔獲得)，小心加入病毒混合液，十字形慢慢晃動(dòng)3次，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h后分別收集病毒上清和細(xì)胞沉淀，-80℃至37℃反復(fù)凍融3次，600 r/min離心20 min去沉淀取上清，反復(fù)擴(kuò)增至需要病毒量。用氯化銫密度梯度離心法純化病毒，并用50%組織培養(yǎng)感染計(jì)量法(TCID50)測(cè)定病毒滴度〔3〕。

1.4 病毒的表達(dá)

將3×106個(gè)A549細(xì)胞接種于35 cm2培養(yǎng)瓶中，用10%FBS/RPMI1640培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液加入按MOI值為5稀釋于1.2 ml無雙抗無血清RPMI1640培養(yǎng)液中的CNHK500-hTRAIL病毒，十字形輕輕晃動(dòng)3次，37℃5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每隔20 min十字形晃動(dòng)兩次培養(yǎng)2h后加入2%FBS/RPMI1640培養(yǎng)液8 ml繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，用Trizol法提取總RNA后用RT-PCT試劑盒合成第一鏈總cDNA，再以總cDNA為模板用hTRAIL引物，以GAPDH為內(nèi)參照進(jìn)行PCR擴(kuò)增。hTRAIL引物序列：上游引物：5'-CCCATCGATGGGATGACCTCTGAGGAAACC-3'，下游引物：5'-CTAGTCTAGA CTAGTTAGCCAACTAAAAA-3'。

1.5 不同MOI值CNHK500-hTRAIL對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

取對(duì)數(shù)成長(zhǎng)期的肺腺癌細(xì)胞A549接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為5×103，細(xì)胞液量為 150 μl，接種細(xì)胞在 5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，用不同MOI值CNHK500-hTRAIL感染。用無雙抗RPMI1640培養(yǎng)液稀釋由低至高共12個(gè)MOI值病毒液，即 0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、40，每組設(shè)6復(fù)孔，加入病毒液50 μl/孔后在CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)90 min，每隔15 min中十字輕搖一次，最后再加150 μl 10%FBS/RPMI1640，繼續(xù)培養(yǎng)5 d用MTT比色法檢測(cè)OD值〔4〕。

細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.6 CNHK500-hTRAIL聯(lián)合X射線照射對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

實(shí)驗(yàn)分為 7組，即 A549/0 Gy、A549/CNHK500/0 Gy、A549/1 Gy、A549/2 Gy、A549/CNHK500-hTRAIL/0 Gy、A549/CNHK500-hTRAIL/1 Gy和 A549/CNHK500-hTRAIL/2 Gy。取對(duì)數(shù)成長(zhǎng)期的 A549細(xì)胞接種于96孔板，5×103/孔。置于37℃、50 ml/L CO2孵箱內(nèi)培育24 h后以 MOI值為5感染CNHK500-hTRAIL及空病毒CNHK500(病毒感染方法同上)病。病毒感染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，進(jìn)行不同劑量(1和2 Gy)X射線照射。照射條件：深部X射線治療機(jī)，電壓為180 V，電流為18 mA，劑量率為0.38 Gy/min。照射后3 d用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，并分析CNHK500-hTRAIL和X射線是否具有協(xié)同作用。MTT法同上。參照夏云飛等〔5，6〕提出的計(jì)算E/O值(預(yù)期值/觀察值)的方法來判斷兩種干預(yù)因素之間有無協(xié)同作用。當(dāng)E/O＞1.4時(shí)，認(rèn)為有協(xié)同作用。E=(T2/T1)×(T3/T1);O=(T4/T1)，其 中 T2/T1、T3/T1、T4/T1 分 別 為 A549/CNHK500、A549/1 Gy(或 2 Gy)、A549/CNHK500-hTRAIL/1 Gy(或2 Gy)的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 重組病毒鑒定

擴(kuò)增出hTRAIL基因(521 bp)及mcmv啟動(dòng)子基因(846 bp)。經(jīng)鑒定與陽性對(duì)照(pPE3-hTrail質(zhì)粒)一致，兩個(gè)克隆均為CNHK500-hTRAIL，證實(shí)CNHK500-hTRAIL病毒構(gòu)建成功。見圖1。

M：Gene Ruler DNA Ladder Mix;N：陰性對(duì)照;P：pPE3-hTRAIL 質(zhì)粒;1、2為病毒 CNHK500-hTRAIL的2個(gè)病毒克隆;M左為 AT310+AT311擴(kuò)增hTRAIL基因(521 bp)，M右為GT210+GT211擴(kuò)增mcmv啟動(dòng)子(846 bp)

2.2 重組病毒的純化、擴(kuò)增及滴度測(cè)定

選擇克隆1病毒CNHK500-hTRAIL在293細(xì)胞中反復(fù)擴(kuò)增后收集病毒液用氯化銫梯度離心法進(jìn)行純化得到的病毒液用50%組織培養(yǎng)感染計(jì)量法測(cè)定病毒滴度。CNHK500-hTRAIL病毒滴度為3.25×109PFU/ml。

2.3 目的基因表達(dá)

感染CNHK500-hTRAIL病毒的A549細(xì)胞中擴(kuò)增出目的基因hTRAIL片段(596 bp)和GAPDH基因片段(490 bp)，對(duì)照組A549細(xì)胞中只擴(kuò)增出GAPDH基因片段。見圖2。

2.4 不同MOI值CNHK500-hTRAIL對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

隨MOI值由低到高，細(xì)胞存活率總體下降的趨勢(shì)為(96.02±2.61)%、(94.52±3.92)%、(90.46±2.25)%、(91.98±2.27)%、(88.02±3.07)%、(86.59±3.28)%、(87.72±4.09)%、(85.77±2.57)%、(79.15±4.48)%、(76.40±3.50)%、(67.18±4.83)%、(64.26±2.19)%。最高值和最低值相差約1.5倍，提示CNHK500-hTRAIL對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)具有明顯的抑瘤作用。選擇CNHK500-hTRAIL的MOI值5作為研究與X射線聯(lián)合抑瘤效應(yīng)的病毒感染滴度。

2.5 CNHK500-hTRAIL聯(lián)合X射線照射對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

不同劑量(1和2 Gy)X射線照射對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用(P＜0.01)。單純CNHK500-hTRAIL組對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)也有明顯的抑制作用(P＜0.05)。CNHK500-hTRAIL聯(lián)合X線照射(1 Gy和2 Gy)肺腺癌細(xì)胞A549，使其存活分?jǐn)?shù)明顯低于對(duì)應(yīng)相同劑量單純照射組(均為P＜0.01)，其中2 Gy聯(lián)合照射組抑制作用更明顯(P＜0.05)。提示，CNHK500-hTRAIL聯(lián)合X線照射對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞有顯著抑瘤作用，優(yōu)于單純CNHK500-hTRAIL感染組及單純照射組。計(jì)算E/O值(預(yù)期值/觀察值)的方法來判斷CNHK500-hTRAIL和X線照射之間有無協(xié)同作用，CNHK500-hTRAIL聯(lián)合1 Gy照射時(shí)E/O值為1.5，CNHK500-hTRAIL聯(lián)合2Gy照射時(shí) E/O為1.6，兩者均大于 1.4，提示CNHK500-hTRAIL與X射線照射對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有協(xié)同抑制作用。見表2。

圖2hTRAIL基因RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

表2CNHK500-hTRAIL聯(lián)合X射線照射對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(± s，n=6)

表2CNHK500-hTRAIL聯(lián)合X射線照射對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(± s，n=6)

與CNHK500/0 Gy比較：1)P＜0.05;與 A549/1 Gy組比較：2)P＜0.01;與A549/2 Gy比較：3)P ＜0.01;與 CNHK500-hTRAIL/0 Gy組比較：4)P ＜0.01

組別 細(xì)胞存活率(%)A549/0 Gy 100 A549/CNHK500/0 Gy 95.17±4.78 A549/CNHK500-hTRAIL/0 Gy 84.51±3.171)A549/1 Gy 4±1.82 A549/2 Gy 83.51±3.98 A549/CNHK500-hTRAIL/1 Gy 50.77±4.262)4)A549/CNHK500-hTRAIL/2 Gy 45.56±3.653)4)

3 討論

惡性腫瘤的腫瘤基因放射治療，因其可通過基因的介導(dǎo)來增強(qiáng)放射治療療效，所以也越來越得到研究者們的關(guān)注。目前為提高惡性腫瘤基因-放射治療的治療效果，研究的關(guān)鍵是：①進(jìn)一步選擇有效的治療基因;②借助轉(zhuǎn)染效率較高的載體系統(tǒng)最大限度地將基因?qū)胧荏w細(xì)胞和靶細(xì)胞;③提高腫瘤基因治療的靶向性。人的 TRAIL基因位于染色體3p26 h，編碼32.5 kD的Ⅱ型跨膜蛋白，由281個(gè)氨基酸組成，是TNF超家族成員之一，TRAIL與腫瘤細(xì)胞的死亡受體TRAIL-R1/DR4和TRAIL-R2/DR5結(jié)合后，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)，激發(fā)Caspase蛋白酶解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡〔7〕。肝、肺等多種腫瘤細(xì)胞株都對(duì)TRAIL敏感，TRAIL在腫瘤基因治療領(lǐng)域受到了越來越多的重視〔8〕。

一種新型的雙靶向溶瘤腺病毒CNHK500是利用人實(shí)體瘤內(nèi)存在端粒酶陽性和缺氧微環(huán)境兩個(gè)重要特性，分別用人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子(hTERT promoter)調(diào)控腺病毒復(fù)制必需基因E1A基因，用缺氧反應(yīng)啟動(dòng)子(HRE promoter)調(diào)控腺病毒復(fù)制必須基因E1B基因，因此CNHK500只有在端粒酶陽性和缺氧微環(huán)境的人實(shí)體瘤內(nèi)選擇增殖。CNHK500的E3區(qū)可插入目的基因表達(dá)盒。CNHK500對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性增殖能力明顯優(yōu)于單純?nèi)硕肆Ｃ改孓D(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子調(diào)控的腺病毒CNHK300及國(guó)際上公認(rèn)的腫瘤增殖病毒ONYX-015，提高了療效/毒性比。目前，CNHK500是國(guó)際上最為廣譜和特異性的溶瘤病毒及基因-病毒治療系統(tǒng)〔9〕。

本文結(jié)果CNHK500-hTRAIL感染與X射線聯(lián)合照射對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)具有協(xié)同抑制作用，其可能與CNHK500-hTRAIL提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性有關(guān)。理論上雙靶向腺病CNHK500-hTRAIL只能在端粒酶陽性的實(shí)體瘤的微缺氧環(huán)境下增殖，但本研究及劉永靖等〔10〕研究均證實(shí)，其也在體外培養(yǎng)的其他端粒酶陽性的腫瘤細(xì)胞中有效表達(dá)，并具有顯著地生長(zhǎng)抑制作用或促凋亡作用。劉永靖等〔10〕研究報(bào)道，通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)CNHK500-hTRAIL選擇性地在端粒酶陽性的肝癌細(xì)胞株HepG2、Hep3B中的增殖能力顯著，比在正常肝細(xì)胞WRL-68中的增殖能力高出300倍之多，TRAIL表達(dá)量是正常細(xì)胞的約9倍，并可顯著誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。

CNHK500-hTRAIL感染與X射線聯(lián)合照射對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)的協(xié)同抑制作用還有待于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步證實(shí)。本研究為實(shí)驗(yàn)基因-放射治療提供了重要理論依據(jù)。

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R737.14

A

1005-9202(2012)23-5221-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.055

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.200905186)

1 上海東方肝膽外科醫(yī)院病毒與基因治療中心

張海英(1970-)，女，副教授，博士，主要從事放射生物學(xué)及輻射防護(hù)研究。

樸春姬(1969-)，女，副教授，博士，主要從事實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤基因放射治療研究。

〔2012-03-12收稿 2012-06-07修回〕

(編輯 趙慧玲/張 慧)