王艷杰 任艷玲 宋 囡 李亞玲 呂海波 趙金茹 (遼寧中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，遼寧 沈陽 110032)

左歸丸對去卵巢大鼠股骨中Ⅰ型膠原mRNA表達的影響

王艷杰 任艷玲 宋 囡 李亞玲 呂海波 趙金茹 (遼寧中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，遼寧 沈陽 110032)

目的 觀察左歸丸對去卵巢骨質疏松(OP)模型大鼠股骨中Ⅰ型膠原mRNA表達的影響，探討左歸丸對OP的防治作用機制。方法

SPF級4.5月齡SD雌性大鼠，分為三組：正常組39只;假手術組39只;200只采取雙側背部卵巢切除術進行絕經(jīng)后OP造模。造模21 d后，將去卵巢大鼠隨機分為5組：模型組、尼爾雌醇組、左歸丸高劑量組、左歸丸中劑量組、左歸丸低劑量組，每組40只。然后開始灌胃給藥，左歸丸高、中、低劑量組分別給予ig6.4，3.2，1.6 g/kg劑量的左歸丸混懸液灌胃;尼爾雌醇組灌服尼爾雌醇混懸液灌胃;正常組、假手術組和模型組均灌服蒸餾水。于連續(xù)給藥60、120、180 d后分3批取材，取大鼠左后肢股骨近端1/3部分，采用RT-PCR方法檢測骨組織中Ⅰ型膠原mRNA的表達水平。結果 去卵巢后，與正常組比較，模型組大鼠股骨中Ⅰ型膠原 mRNA水平明顯降低(P＜0.01);和模型組比較，給藥60d、120、180 d的左歸丸各劑量組，股骨中Ⅰ型膠原mRNA水平顯著升高(P＜0.01或P＜0.05)。結論 骨組織中Ⅰ型膠原的mRNA表達水平的下調可能是絕經(jīng)后骨質疏松(PMOP)發(fā)生的重要機制之一，左歸丸能夠上調骨組織中Ⅰ型膠原的mRNA表達，從而有效防治OP。

左歸丸;骨質疏松癥;Ⅰ型膠原

絕經(jīng)后骨質疏松(PMOP)是女性絕經(jīng)以后，隨著循環(huán)中雌激素水平的降低而出現(xiàn)的以全身性骨量減少和骨組織微細結構破壞為特征，繼而導致骨脆性增加，骨折危險性增高的骨骼疾病。中醫(yī)學中無(OP)此病名，但依據(jù)其病因病機及臨床表現(xiàn)，將其歸為“骨痿”范疇。中醫(yī)認為腎藏精，主骨生髓，骨骼的生長、發(fā)育及修復均有賴于腎中精氣的滋養(yǎng)和推動，故腎虛是絕經(jīng)后OP發(fā)病的主要原因。左歸丸出自張景岳的《景岳全書·新方八陣》，為補腎填精的名方。本實驗采取去卵巢造模方法建立大鼠PMOP模型，以腎虛為PMOP的主要發(fā)病原因出發(fā)，研究左歸丸對PMOP大鼠股骨中Ⅰ型膠原mRNA水平的影響，為臨床防治PMOP提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

SPF級 SD雌性大鼠280只，4.5月齡，體重270～290 g，由上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供〔許可證號：SCXK(滬)2008-0016〕。適應性喂養(yǎng)1 w，室溫20℃ ～25℃，濕度20% ～30%，自由攝食、飲水，飼料為全價顆粒飼料(Ca：0.5%)。

1.2 實驗藥品及主要試劑

硫酸慶大霉素注射液(鄭州羚銳制藥股份有限公司，批號：0811121);左歸丸中成藥(上海雷允上封浜制藥有限公司，批號：090409);尼爾雌醇片〔上海醫(yī)藥(集團)有限公司新華聯(lián)〕;TMPlus試劑盒，TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕;SuperBuffer-2超快核酸電泳液，DNA電泳分子量標準(北京天恩澤基因科技有限公司);Gene Finder核酸染料，6×Loading Buffer DNA染料(廈門百維信生物科技有限公司)。

1.3 主要儀器及設備

TU-1810PC型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);Heal Fore Neofuge13臺式高速冷凍離心機(上海力申科學儀器有限公司);Mycycler TM Thermal Cycler PCR擴增儀(美國BIO-RAD);EPS 300天能電泳儀(上海天能科技有限公司);WD-9413B凝膠成像分析儀(北京六一儀器廠)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 將實驗大鼠按體重隨機分層，每層按數(shù)量比暫分為三組：正常組40只;假手術組40只;其余200只實施雙側卵巢切除術造模。造模21 d后，將存活大鼠隨機分為5組：模型組、尼爾雌醇組、左歸丸高劑量組、左歸丸中劑量組、左歸丸低劑量組每組39只。

1.4.2 造模方法 大鼠經(jīng)10%的水合氯醛0.35 ml/100 g腹腔注射麻醉，由大鼠背部脊柱兩側入路完整摘除卵巢后，滴入10%的硫酸慶大霉素(0.4萬U)0.5 ml，以防感染，之后將脂肪團放回腹腔，用同樣方法摘除另一側卵巢;假手術組僅將卵巢從腹腔提出而不切除，僅切除卵巢周圍少量脂肪組織，逐層縫合傷口，用碘伏棉球消毒。以上手術操作均在無菌環(huán)境下進行。術后每只大鼠腹腔注射10%硫酸慶大霉素(0.4萬U)1 ml/d，連續(xù)注射6 d后停藥，之后若有呼吸異常者，則給予單籠隔離飼養(yǎng)，早晚分別給予腹腔注射10%硫酸慶大霉素(0.4萬U)1 ml/次。

1.4.3 給藥方法及劑量 造模21 d后，除正常組、假手術組和模型組外進行藥物治療，根據(jù)人與大鼠等劑量換算公式折算大鼠左歸丸的等臨床劑量為1.6 g/kg體重，并設為低劑量組。左歸丸高、中、低劑量組大鼠分別給予左歸丸 6.4、3.2、1.6 g/kg，1次/d;尼爾雌醇組給予尼爾雌醇 0.21 mg/kg，1次/w;使用前分別將左歸丸和尼爾雌醇片用蒸餾水制成混懸液，定溶至所需濃度，10 ml/kg，灌服;尼爾雌醇組未灌藥期間均灌服蒸餾水，10 ml/kg，1次/d;正常組、假手術組、模型空白組均灌服蒸餾水，10 ml/kg體重，1次/d;每周給予稱重1次，并根據(jù)體重調整給藥量。

1.4.4 標本采集 實驗大鼠連續(xù)給藥60、120、180 d后分三次取材，取材前所有大鼠禁食、禁水24 h。大鼠經(jīng)10%的水合氯醛0.35 ml/100 g腹腔注射麻醉。取大鼠左后肢股骨近端1/3部分，剔除軟組織及筋膜，用DEPC水處理過的鋁箔紙包裹好，做好標記，迅速置入液氮中速凍，之后放入-70℃冰箱保存，以備RT-PCR方法檢測骨組織中Ⅰ型膠原mRNA的表達。

1.4.5 RT-PCR測定大鼠骨組織中Ⅰ型膠原的mRNA表達水平 用液氮充分預冷研缽，迅速將股骨放入預冷的研缽中，用研杵研磨骨組織，直至骨組織被研磨成白色粉末;向研缽中加入2 ml的RNAiso TM Plus，將白色粉末完全覆蓋，室溫靜置，直至樣品完全融化，再用研杵繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀;將勻漿液轉移至離心管中，每管大約1 ml，室溫靜置5 min;離心;吸取上清液，移入新的離心管中;加入 200 μl氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫靜置5 min;離心;吸取上層水相至另一新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻，靜置10 min;離心10 min，小心棄去上清，加入75%的乙醇1 ml，上下顛倒洗滌RNA沉淀，離心5 min后小心棄去乙醇;室溫干燥沉淀2～5 min，之后加入適量的DEPC水(30～60 μl/管)溶解沉淀，-80℃保存。用紫外分光光度計測定 260、280 nm下的吸光度，并計算 OD260/OD280，取在1.8～2.2之間樣品進行實驗;根據(jù)RT-PCR試劑盒說明配制包含MgCl2、10×RT緩沖液、dNTP混合物、RNase抑制劑、Oligo dT、逆轉錄酶等的10 μl逆轉錄反應體系，進行逆轉錄，然后配制25 μl PCR反應體系，包括上述RT反應液、5×PCR緩沖液、滅菌水和引物(具體序列見表1)及EX Taq HS。反應條件：①94℃，2 min預變性;②94℃，30 s變性;③59℃，30 s退火;④72℃，1 min延伸;⑤72℃，5 min延伸;其中② ～ ④為30個循環(huán)。反應結束后進行瓊脂糖凝膠電泳，用WD-9413B凝膠成像分析儀進行拍照，并用Gel pro32凝膠圖像分析軟件對PCR產(chǎn)物進行半定量分析測定，Ⅰ型膠原的mRNA表達水平用Ⅰ型膠原/β-actin的光密度比值來表示。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 給藥60 d后左歸丸對骨組織中Ⅰ型膠原的mRNA表達水平的影響

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，通過圖像分析軟件檢測，各個組分別于 193 bp(Ⅰ型膠原)、592 bp(β-actin)見到擴增的條帶(見圖1)，表明擴增條帶與設計的引物相符合。經(jīng)半定量RT-PCR檢測顯示：和正常組比較，假手術組骨組織中Ⅰ型膠原mRNA水平無明顯差異(P＞0.05);與正常組比較，模型組大鼠大鼠骨組織中Ⅰ型膠原mRNA水平明顯降低(P＜0.01);和模型組比較，左歸丸高、中、低劑量組骨組織中Ⅰ型膠原mRNA水平顯著上升(P＜0.01)，各用藥組之間無顯著性差異(P＞0.05)，和模型組比較，尼爾雌醇組骨組織中Ⅰ型膠原的mRNA水平顯著上升(P＜0.01)。見表2。

圖1 不同時間各組大鼠骨組織中Ⅰ型膠原mRNA表達的電泳照片

2.2 給藥120 d后左歸丸對骨組織中Ⅰ型膠原的mRNA表達水平的影響

和正常組比較，假手術組骨組織中Ⅰ型膠原的mRNA水平無明顯差異(P＞0.05);與正常組比較，模型組骨組織中Ⅰ型膠原的mRNA水平明顯降低(P＜0.01);和模型組比較，左歸丸高、中劑量組骨組織中Ⅰ型膠原的mRNA水平顯著上升(P＜0.01)，左歸丸低量組骨組織中Ⅰ型膠原的mRNA水平顯著上升(P＜0.05);和左歸丸低劑量組比較，左歸丸高量組骨組織中Ⅰ型膠原的mRNA水平顯著升高(P＜0.05);和模型組比較，尼爾雌醇組骨組織中Ⅰ型膠原的mRNA水平顯著上升(P＜0.01)。見表2。

2.3 給藥180 d后左歸丸對骨組織中Ⅰ型膠原的mRNA表達mRNA表達的影響

和正常組比較，假手術組骨組織中Ⅰ型膠原的mRNA水平無明顯差異(P＞0.05);與正常組比較，模型組大鼠大鼠骨組織中Ⅰ型膠原的mRNA水平明顯降低(P＜0.01);和模型組比較，左歸丸各劑量組骨組織中Ⅰ型膠原的mRNA水平顯著上升(P＜0.01);和左歸丸低劑量組比較，左歸丸高、中量組骨組織中Ⅰ型膠原的mRNA水平顯著升高(P＜0.01，P＜0.05);和模型組比較，尼爾雌醇組骨組織中Ⅰ型膠原的mRNA水平顯著上升(P＜0.01)。見表2。

表2 不同時間各組大鼠骨組織Ⅰ型膠原mRNA表達水平的變化± s，n=6)

表2 不同時間各組大鼠骨組織Ⅰ型膠原mRNA表達水平的變化± s，n=6)

與正常組比較：1)P＜0.01;與模型組比較：2)P＜0.05，3)P＜0.01;與左歸丸低劑量組比較：4)P＜0.05，5)P＜0.01

組別60 d 120 d 180 d正常組0.73±0.07 0.91±0.06 0.93±0.02假手術組 0.71±0.05 0.90±0.01 0.92±0.04模型組 0.42±0.051) 0.72±0.021) 0.72±0.061)尼爾雌醇組 0.59±0.043) 0.86±0.023) 0.89±0.043)左歸丸高劑量組 0.58±0.043) 0.84±0.023)4)0.93±0.043)5)左歸丸中劑量組 0.55±0.043) 0.81±0.023) 0.90±0.013)4)左歸丸低劑量組 0.51±0.023) 0.78±0.032) 0.84±0.023)

3 討論

女性一般在50歲出現(xiàn)絕經(jīng)，在絕經(jīng)后10年內(nèi)骨量丟失明顯加快，絕經(jīng)5年以內(nèi)骨量丟失最快〔1〕。PMOP屬于原發(fā)性OP的一種，為高轉換型OP，以松質骨變化為主，故常見脊椎和腕部骨折〔2〕。雌激素替代療法(ERT)被認為是治療PMOP的有效方法，但ERT長期應用的依從性較差，使其應用受到一定的限制〔3〕。OP屬于中醫(yī)的“骨痹”或“骨痿”范疇。中醫(yī)理論認為“腎為先天之本”，主生長發(fā)育與生殖;“腎藏精主骨生髓”，骨骼的生長、發(fā)育、修復均依賴于腎中精氣的腎藏精，充盈、滋養(yǎng)與推動。《素問·痿論》曰：“腎者水臟也。今水不勝火，則骨枯而髓虛故足不任身，發(fā)為骨痿?！币虼薕P的發(fā)生主要是由于腎精虧虛所致，故內(nèi)經(jīng)中有“骨痿者，補腎法治之”的明確論述。絕經(jīng)后婦女由于腎氣虛衰，沖任不足，精枯髓少，充養(yǎng)乏源，骨失所養(yǎng)，則骨體枯槁，無以作強，則發(fā)為腰膝酸軟、行走不便的骨痿或骨痛、骨痹。因此，補腎填精是防治PMOP的根本方法。左歸丸為張景岳所創(chuàng)之經(jīng)典方劑，具有滋陰補腎的功效。本實驗研究采用的補腎名方左歸丸出自《景岳全書》，方中熟地黃滋腎以填真陰;枸杞子益精明目;山茱萸澀精斂汗;龜、鹿二膠，為血肉有情之品，鹿角膠偏于補陽，龜板膠偏于滋陰，兩膠合力，溝通任督二脈，益精填髓，有補陰中包涵“陽中求陰”之義;菟絲子配牛膝，強腰膝，健筋骨;山藥滋益脾腎，諸藥合用共收滋腎填陰，育陰潛陽之效。有文獻報道左歸丸能夠卵巢切除大鼠外周血清中降鈣素(CT)含量明顯增高，骨鈣素(BGP)含量明顯降低〔4〕。本課題組的前期研究結果表明左歸丸含藥血清能夠促進MC3T3-E1成骨前體細胞增殖，能夠上調MC3T3-E1成骨前體細胞Runx2 mRNA的表達〔5〕。雙側去除卵巢后模型空白組大鼠腎組織內(nèi)TGF-β1/Smad4信號轉導通路出現(xiàn)異常，表現(xiàn)為TGF-β1、Smad4的mRNA水平過高表達，且骨密度降低，給予左歸丸治療60 d后，腎組織中TGF-β1、Smad4的表達均有下調趨勢且骨密度顯著升高，提示左歸丸能通過下調腎組織中TGF-β1、Smad4的mRNA表達抑制骨吸收，糾正骨代謝紊亂，改善去絕經(jīng)后機體腎虛的狀態(tài)，通過補腎填精的途徑起到防治PMOP的作用〔6〕。但是左歸丸對OP時骨組織中Ⅰ型膠原表達的影響研究尚屬空白。

Ⅰ型膠原是骨有機質的主要成分，占90%，由兩條α1鏈和一條α2鏈交聯(lián)而成。Ⅰ型膠原構成了骨組織蛋白框架，Ⅰ型膠原的合成與分解也是骨組織合成與吸收的直接和特異性指標。Ⅰ型膠原缺陷對骨密度影響不大，但可引起骨強度明顯降低。Ⅰ型膠原的走向也可影響骨強度，較多的縱向膠原纖維可增加抗張力強度，混合性膠原可加強抗壓力強度。OP使骨強度下降，因此Ⅰ型膠原在骨質疏松病因學中的作用機制受到廣泛關注〔7〕。Ⅰ型膠原可以很好地反映骨代謝水平，還與骨密度改變、椎體及髖部骨折率良好相關，其敏感性、特異性、穩(wěn)定性均高于以往的骨檢測指標;對早期診斷和治療OP，判斷藥物療效和機制，預測骨折危險性具有重要價值。因此本實驗觀察了治療不同時間、不同劑量左歸丸對去卵巢大鼠股骨中Ⅰ型膠原mRNA表達的影響，進一步探索左歸丸對骨強度的影響。本實驗結果說明Ⅰ型膠原的mRNA表達水平降低與OP發(fā)病密切相關;左歸丸能夠上調股骨組織中的Ⅰ型膠原mRNA表達水平，從而糾正OP時的骨代謝異常，這可能是左歸丸作為補腎填精方劑防治PMOP的作用途徑之一。

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3 段水竹.中醫(yī)藥防治絕經(jīng)后骨質疏松癥的實驗研究進展〔J〕.中國骨質疏松雜志，2006;12(6)：643-4.

4 鞠大宏，吳 萍，賈紅偉，等.左歸丸對卵巢切除所致骨質疏松大鼠骨鈣素和降鈣素含量的影響〔J〕.中國中醫(yī)藥信息雜志，2003;10(1)：16-7.

5 劉立萍，任艷玲，李 然，等.JUK通路對左歸丸含藥血清調控MC3T3成骨細胞Runx2 mRNA表達的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2012;18(14)：123-6.

6 任艷玲，李婭玲，呂海波，等.左歸丸對去卵巢骨質疏松大鼠腎臟TGF-β1/Smad4 mRNA表達的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2012;18(10)：171-5.

7 黃 強，沈 彬.Ⅰ型膠原與原發(fā)性骨質疏松的相關性研究進展〔J〕.華西醫(yī)學，2009;24(1)：244-7.

Expressions of collagenⅠmRNA of femoral organization by Zuogui Pill in ovariectomy-induced osteoporosis rats

WANG Yan-Jie，REN Yan-Ling，SONG Nan，et al.
Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，Liaoning，China

Objective To observe the expression of collagenⅠmRNA of femoral organization by Zuogui Pill in ovariectomy-induced osteoporosis rats.Methods 280 male SPF SD rats were divided into normal and sham groups(n=39)and the other 195 rats were divided into ovariectomy-induced osteoporosis model group.21 days later，osteoporosis model rats were randomly divided into 5 groups：the model，nilestriol，high，middle and low dose of Zuogui pill groups(n=39).Then rats were given i.g.with Zuogui Pill at dosage of 6.4，3.2，1.6 g·kg-1·d-1and nilestriol respectively.Rats in normal，sham and the model groups were given distilled water.After treated with medicine 60，120，180 days，the expression of collagenⅠin the femoral organization was examined by RT-PCR.Results Compared with the normal group，the femoral collagenⅠ mRNA level obviously was reduced in model group(P＜0.01).Compared with the model group，collagenⅠmRNA level was significantly increased in Zuogui Pill groups(P＜0.01 orP＜0.05).Conclusions Expression of collagenⅠmRNA of bone tissue is down-regulated in postmenopausal osteoporosis，Zuigui pill can be up-regulated mRNA expression of collagenⅠin bone tissue.

Zuogui Pill;Osteoporosis;Collagen Ⅰ

R289.5 〔

A

1005-9202(2012)23-5170-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.032

國家自然科學基金項目(No.30873226);教育部高等學校博士學科點專項科研基金(No.20102133110001);遼寧省高等學校優(yōu)秀人才支持計劃(No.LR201025);遼寧省科技廳自然基金(No.201102148)

任艷玲(1963-)，女，教授，博士生導師，主要從事方藥配伍規(guī)律及作用機制的研究。

王艷杰(1976-)，女，副教授，碩士生導師，博士，主要從事中醫(yī)藥對臟腑調控作用的信號轉導機制研究。

〔2012-07-26收稿 2012-10-10修回〕

(編輯 曹夢園)