楊美玉，丁 飛，蔣小崗，吳勰星，顧振綸，郭次儀，卞士中

（1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)系 蘇州大學(xué)司法鑒定所，江蘇 蘇州 215123；2.上海市公安局寶山分局刑事科學(xué)研究所，上海 寶山 201900；3.蘇州中藥研究所，江蘇 蘇州 215006；4.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部臨床醫(yī)學(xué)系，江蘇 蘇州 215123）

氯胺酮與酒精對小鼠學(xué)習(xí)記憶行為的影響

楊美玉1，3，丁 飛2，蔣小崗3，吳勰星4，顧振綸3，郭次儀3，卞士中1

（1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)系 蘇州大學(xué)司法鑒定所，江蘇 蘇州 215123；2.上海市公安局寶山分局刑事科學(xué)研究所，上海 寶山 201900；3.蘇州中藥研究所，江蘇 蘇州 215006；4.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部臨床醫(yī)學(xué)系，江蘇 蘇州 215123）

目的 研究氯胺酮與酒精對小鼠學(xué)習(xí)記憶的行為學(xué)及相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的影響。 方法 40只小鼠分為4組：對照組、氯胺酮組、酒精組、氯胺酮酒精聯(lián)合給藥組，每組10只。氯胺酮和酒精分別采用腹腔注射和灌胃給藥的方式，1次/d，連續(xù)14d。通過跳臺和水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測各組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，通過測定小鼠大腦組織中乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）和5-羥色胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT）的含量初步探討氯胺酮與酒精對小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響機(jī)制。 結(jié)果 （1）跳臺實(shí)驗(yàn)：給藥組小鼠均出現(xiàn)潛伏期縮短，錯(cuò)誤次數(shù)增多（P＜0.05）。與單獨(dú)給藥相比，聯(lián)合給藥組錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加。（2）水迷宮實(shí)驗(yàn)：給藥組小鼠潛伏期顯著增加（P＜0.05），平臺所在象限活動(dòng)時(shí)間明顯縮短（P＜0.05），穿臺次數(shù)顯著減少（P＜0.05）。（3）生化指標(biāo)測定：各給藥組ACh和5-HT含量明顯下降，且聯(lián)合給藥組較單獨(dú)給藥組下降更為明顯（P＜0.05）。 結(jié)論 氯胺酮和酒精對小鼠學(xué)習(xí)記憶行為的抑制具有協(xié)同作用，這可能與共同抑制5-HT和ACh含量的降低有關(guān)。

法醫(yī)毒理學(xué)；氯胺酮；酒精；學(xué)習(xí)；記憶；小鼠

氯胺酮為苯環(huán)己哌啶（phencylidine，PCP）衍生物，是非競爭性N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體拮抗劑，作為一種靜脈麻醉藥，已在臨床應(yīng)用多年。研究認(rèn)為氯胺酮可介導(dǎo)精神分裂樣癥狀[1]和認(rèn)知障礙[2]。重復(fù)注射氯胺酮可使大鼠海馬內(nèi)NMDA受體數(shù)量下降和NMDA受體亞單位的改變，NMDA受體數(shù)量和結(jié)構(gòu)組成的改變可嚴(yán)重?fù)p害包括學(xué)習(xí)記憶在內(nèi)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能[3]。目前對氯胺酮致認(rèn)知障礙的研究多集中于臨床麻醉，而就其基于亞急性中毒或成癮性的研究較少。本研究以小鼠為實(shí)驗(yàn)對象，觀察氯胺酮與酒精對小鼠學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)改變及相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR小鼠，雄性，體質(zhì)量25～30 g，由蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3d，維持室溫（22±1）℃，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中小鼠自由飲水和進(jìn)食。

1.2 藥品和儀器

鹽酸氯胺酮注射液（國藥準(zhǔn)字H32022820，批號KH071004，2mL：0.1 g）購自江蘇恒瑞醫(yī)藥公司，56%紅星二鍋頭酒購自北京紅星股份有限公司，乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）試劑盒購自南京建成生物工程研究所，5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）ELISA試劑盒購自美國Ramp;D公司。

Morris水迷宮裝置（上海移數(shù)信息科技有限公司），STT-2跳臺儀（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）。

1.3 模型制備與給藥[4]

實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對照組、氯胺酮組、酒精組、聯(lián)合給藥組共4組。給藥方式為：對照組以生理鹽水腹腔注射＋生理鹽水灌胃，酒精組以生理鹽水腹腔注射＋酒精灌胃，氯胺酮組以氯胺酮腹腔注射＋生理鹽水灌胃，聯(lián)合給藥組以氯胺酮腹腔注射＋酒精灌胃。腹腔注射量：生理鹽水0.01 mL/g，氯胺酮0.05 mg/g，每天1次，連續(xù)14 d；灌胃劑量：生理鹽水、酒精（紅星二鍋頭稀釋至20%）[6]0.01mL/g，每天1次，連續(xù)14d。各組小鼠每天9：00給藥。

1.4 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)[7]

1.4.1 跳臺實(shí)驗(yàn)

用藥前一天先將小鼠放入反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng)3 min后，通電電擊。訓(xùn)練時(shí)跳臺潛伏期大于180s者棄去不用。選定40只小鼠，記錄小鼠5min內(nèi)第1次從平臺跳下的時(shí)間（潛伏期）和跳下的次數(shù)（錯(cuò)誤次數(shù)），以錯(cuò)誤次數(shù)作為基礎(chǔ)成績將小鼠分成3組，使各組小鼠智力水平接近。然后按分層隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)[5]，將小鼠分為對照組、酒精組、氯胺酮組和聯(lián)合給藥組，每組10只。給藥14d后重新測試并記錄各組小鼠跳臺實(shí)驗(yàn)潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)，比較不同組間小鼠記憶成績的差異。

1.4.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

各組小鼠于給藥7d后開始水迷宮實(shí)驗(yàn)，并繼續(xù)給藥至第14天。

1.4.2.1 定位航行實(shí)驗(yàn)

給藥至第7天將4組小鼠均放入不含平臺的水池中自由游泳2min，使其熟悉迷宮環(huán)境。將水池分為4個(gè)象限，平臺所在位置為第2象限。從第8天開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)按照第1、2、3、4象限的順序?qū)⑿∈竺嫦虿⒖拷乇诜湃胨校?jì)算機(jī)軟件系統(tǒng)記錄小鼠從入水到爬上平臺的游泳時(shí)間，即逃避潛伏期。超過120s找不到平臺，可引導(dǎo)其找到平臺。全部小鼠完成1個(gè)象限實(shí)驗(yàn)后再進(jìn)行下1個(gè)象限的測試，直至完成4個(gè)象限的測試，計(jì)算4個(gè)象限的平均潛伏期。每天在一個(gè)固定的時(shí)間段內(nèi)讓每只小鼠按相同象限順序依次進(jìn)行4個(gè)象限的尋找隱匿平臺的游戲訓(xùn)練一次，連續(xù)6d。

1.4.2.2 空間探索實(shí)驗(yàn)

第14天上午進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。測量120s內(nèi)：（1）動(dòng)物在目標(biāo)象限（原平臺所在象限）和其他各象限的游泳時(shí)間（以占120s的百分比計(jì)算）；（2）穿越目標(biāo)（原平臺位置）次數(shù)。

1.5 腦組織ACh和5-HT的生化測定

所有小鼠于行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后斷頭取大腦組織（勻漿后取上清液置于-80℃冰箱內(nèi)保存），組織中ACh和5-HT含量測定按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié) 果

2.1 跳臺實(shí)驗(yàn)

連續(xù)14d給予酒精、氯胺酮及聯(lián)合給藥后，可明顯引起小鼠跳臺作業(yè)障礙，表現(xiàn)為錯(cuò)誤次數(shù)增多、潛伏期縮短、認(rèn)知記憶力顯著下降。各組間方差分析顯示：潛伏期（F=4.159，P=0.013），錯(cuò)誤次數(shù)（F=5.786，P= 0.003）。兩兩比較顯示，各給藥組與對照組相比，潛伏期顯著縮短、錯(cuò)誤次數(shù)增多，聯(lián)合給藥組較氯胺酮、酒精組潛伏期更短、錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加（P＜0.05）。給藥前的基礎(chǔ)成績在各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

2.2 水迷宮實(shí)驗(yàn)

2.2.1 定位航行實(shí)驗(yàn)

連續(xù)給藥7d后，各組小鼠尋找平臺的時(shí)間（逃避潛伏期）隨訓(xùn)練次數(shù)的增加逐漸縮短。方差分析顯示，給藥第8天，聯(lián)合給藥組小鼠逃避潛伏期較對照組延長，酒精組、氯胺酮組與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第9天起給藥組潛伏期均較對照組延長，第13天各組小鼠逃避潛伏期組間差異顯著（F=8.520，P=0.000）。兩兩比較顯示，給藥第10、11、13天，聯(lián)合給藥組較酒精組、氯胺酮組潛伏期顯著增加（P＜0.05，見表2）。各組小鼠水迷宮尋找平臺軌跡圖顯示，正常組小鼠可快速地找到隱匿平臺，路線清晰，路程簡短；而給藥組尋找隱匿平臺軌跡則呈現(xiàn)出不同程度的紊亂，與正常組相比路程明顯變長，且聯(lián)合給藥組變化更為顯著（圖1）。

表1 不同藥物對小鼠跳臺實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響 （n=10，±s）

表1 不同藥物對小鼠跳臺實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響 （n=10，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與聯(lián)合給藥組比較，P＜0.05

組別 給藥前 給藥后潛伏期/s 錯(cuò)誤次數(shù) 潛伏期/s 錯(cuò)誤次數(shù)對照 126.54±126.64 2.36±1.63 170.70±137.07 0.90±1.19酒精 113.36±127.41 2.72±1.84 82.70±115.811）2） 2.20±1.401）2）氯胺酮 121.36±117.35 2.27±1.73 72.00±97.421）2） 2.22±1.301）2）聯(lián)合給藥 134.91±103.14 2.36±2.24 33.78±40.981） 3.44±1.331）

表2 不同藥物對小鼠逃避潛伏期的影響 （n=10，±s，s）

表2 不同藥物對小鼠逃避潛伏期的影響 （n=10，±s，s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與聯(lián)合給藥組比較，P＜0.05

組別 8d 9d 10d 11d 12d 13d對照 79.20±21.59 64.06±19.08 61.31±15.42 51.58±19.07 50.12±16.15 38.75±21.38酒精 89.26±17.92 80.83±20.941） 77.04±14.231）2） 72.51±19.511）2） 68.41±17.781） 62.18±19.181）2）氯胺酮 91.55±19.97 79.32±19.411）2） 73.69±16.341）2） 71.28±15.481）2） 67.20±16.111） 65.73±11.481）2）聯(lián)合給藥 98.85±16.851） 93.57±17.371） 89.04±19.091） 86.07±16.881） 79.26±29.011） 76.73±16.491）

2.2.2 空間探索實(shí)驗(yàn)

各組小鼠在平臺所在象限（第2象限）游泳時(shí)間，與對照組相比，給藥組在目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間比明顯減少，且以聯(lián)合給藥組時(shí)間最短（F=4.725，P= 0.045），說明各種給藥對小鼠空間記憶能力有破壞作用（表3）。

小鼠穿臺次數(shù)各組間方差分析見表3，顯示各給藥組穿臺次數(shù)逐漸降低（F=10.079，P=0.000）。

表3 不同藥物對小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=10，±s，%）

表3 不同藥物對小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=10，±s，%）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與聯(lián)合給藥組比較，P＜0.05

組別 原平臺所在象限游泳時(shí)間 穿臺次數(shù)對照 36.86±8.93 4.13±0.78酒精 30.05±4.181） 2.75±0.661）2）氯胺酮 30.91±4.671） 2.50±1.001）聯(lián)合給藥 26.27±11.581） 2.00±0.501）

2.3 腦組織中ACh和5-HT的生化測定

方差分析顯示各給藥組小鼠腦組織中ACh含量均較對照組降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.892，P=0.000）。兩兩比較顯示，聯(lián)合給藥組ACh含量較氯胺酮組顯著降低（表4）。方差分析顯示，5-HT含量在組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=23.268，P=0.000），兩兩比較顯示，聯(lián)合給藥組5-HT含量較酒精組顯著降低（P＜0.05，見表4）。

表4 不同藥物對小鼠腦組織中ACh和5-HT含量的影響（n=10，±s）

表4 不同藥物對小鼠腦組織中ACh和5-HT含量的影響（n=10，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與聯(lián)合給藥組比較，P＜0.05

組別 ACh/（μg/g） 5-HT/（pg/g）對照 2262.47±95.41 167.59±12.69酒精 1906.86±180.841） 155.27±9.651）2）氯胺酮 1945.70±173.641）2） 142.53±11.621）聯(lián)合給藥 1777.31±119.581） 133.20±8.801）

3 討 論

學(xué)習(xí)和記憶是動(dòng)物和人賴以生存的重要腦功能之一，二者相互聯(lián)系，并受遞質(zhì)和神經(jīng)肽的調(diào)節(jié)。阿片肽、膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)、兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)、腎上腺糖皮質(zhì)激素、NMDA、GABA、NO、P物質(zhì)、血管加壓素、鈣基因相關(guān)肽、神經(jīng)營養(yǎng)因子等均可影響學(xué)習(xí)或記憶過程，直接或通過相互作用來影響學(xué)習(xí)和記憶的某個(gè)環(huán)節(jié)或者方面，從而參與對學(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié)[8]。

氯胺酮是NMDA受體的非特異性阻斷劑。其作用機(jī)制復(fù)雜，涉及NMDA受體、阿片類受體、單胺類受體、乙酰膽堿受體和電壓門控鈣通道受體等。麻醉劑量的氯胺酮可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[9-10]。目前研究認(rèn)為，麻醉劑量的氯胺酮通過阻斷NMDA受體抑制學(xué)習(xí)記憶能力[11-12]，NMDA依賴性的突觸可塑性是海馬區(qū)學(xué)習(xí)記憶形成的重要機(jī)制[13]；同時(shí)α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor，AMPAR）介導(dǎo)的快速興奮性突觸傳遞和整個(gè)大腦NMDA受體活性依賴的調(diào)控起到了關(guān)鍵作用[14]。這兩類受體對神經(jīng)元突觸長時(shí)程增強(qiáng)的產(chǎn)生、維持和學(xué)習(xí)記憶功能至關(guān)重要。

早期研究[15]表明，酒精在較低濃度時(shí)就可對NMDA受體的一個(gè)亞型起作用，以某種方式改變該受體亞型之間的相互配合，從而使得谷氨酸利用受體進(jìn)行的信號傳遞受到破壞，這是一種突觸后調(diào)節(jié)。此外，海馬中的膽堿能受體與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，空間學(xué)習(xí)記憶能力依賴于海馬的ACh，ACh水平高則此能力強(qiáng)。酒精會(huì)抑制多個(gè)腦區(qū)內(nèi)的中樞膽堿能通路，有報(bào)道注射阿片受體拮抗藥納洛酮能明顯增加大鼠海馬內(nèi)ACh的釋放使腦內(nèi)ACh水平升高，從而提高學(xué)習(xí)記憶能力[16]。

文獻(xiàn)報(bào)道，酒精對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷很可能與其初級代謝產(chǎn)物乙醛和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)生的縮合反應(yīng)有關(guān)[17]。其中，多巴胺（DA）、5-HT可與乙醛縮合成內(nèi)源性神經(jīng)毒性物質(zhì)，很可能參與了神經(jīng)通路的退行性病變過程。目前，研究者主要從紋狀體和海馬區(qū)突觸界面結(jié)構(gòu)的變化、長時(shí)程突觸抑制以及一些膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)等的變化方面來研究其對于學(xué)習(xí)記憶的損傷。

本研究選用學(xué)習(xí)記憶經(jīng)典實(shí)驗(yàn)即跳臺實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮對各組實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行行為學(xué)測試。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在跳臺實(shí)驗(yàn)中，給藥后對照組小鼠無明顯異常反應(yīng)，酒精組小鼠跳臺潛伏期明顯縮短，跳臺錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加（P＜0.05）。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組比較，酒精組小鼠逃避潛伏期從第9天開始明顯增加（P＜0.05）；小鼠在平臺所在象限（第2象限）游泳時(shí)間、穿臺次數(shù)與對照組相比明顯減?。≒＜0.05），說明實(shí)驗(yàn)用酒精劑量對小鼠空間記憶能力有破壞作用，給小鼠灌酒引起的學(xué)習(xí)記憶障礙造模成功。氯胺酮組小鼠與對照組比較，給藥后跳臺潛伏期縮短，跳臺錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加（P＜0.05）；Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從第9天開始逃避潛伏期較對照組明顯延長（P＜0.05），小鼠在平臺所在象限游泳時(shí)間與對照組相比明顯減少，穿臺次數(shù)明顯降低（P＜0.05）。聯(lián)合給藥組小鼠在跳臺實(shí)驗(yàn)中，與酒精、氯胺酮、對照組相比，潛伏期減少、錯(cuò)誤次數(shù)增加（P＜0.05）；Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在第10、11、13天逃避潛伏期較酒精組和氯胺酮組明顯增加（P＜0.05）；空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，聯(lián)合給藥組小鼠在平臺所在象限游泳時(shí)間較對照組明顯變少，穿臺次數(shù)顯著降低（P＜0.05）。

小鼠腦組織中生化指標(biāo)測定結(jié)果表明：各給藥組ACh、5-HT含量與對照組比較，均明顯下降（P＜0.05）；聯(lián)合給藥組ACh含量較氯胺酮組明顯減少，5-HT含量較酒精組明顯減少（P＜0.05）。這可能與乙酰膽堿分子合成減少、結(jié)構(gòu)及功能異常有關(guān)，乙酰膽堿對下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路水平的調(diào)控，是膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)認(rèn)知功能的重要機(jī)制，因此需要進(jìn)一步的分子學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究驗(yàn)證。

綜上所述，氯胺酮或酒精單獨(dú)給藥14天后均可造成小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙，氯胺酮和酒精聯(lián)合給藥比單獨(dú)給藥更能使小鼠學(xué)習(xí)記憶減退，說明氯胺酮對于酒精引起的小鼠學(xué)習(xí)記憶行為的抑制具有一定的協(xié)同作用，其機(jī)制可能是通過NMDA受體、乙酰膽堿受體和單胺類受體等途徑的協(xié)同而增強(qiáng)了遺忘作用。

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2011-08-06）

（本文編輯：張欽廷）

Effects of Ketamine and Alcohol on Learning and Memory Impairment in Mice

YANG Mei-yu1,3,DING Fei2,JIANG Xiao-gang3,WU Xie-xing4,GU Zhen-lun3,GUO Ci-yi3,BIAN Shi-zhong1
（1.Institute of Forensic Science of Soochow University,Department of Forensic Medicine,Medical College of Soochow University,Suzhou 215123,China;2.Institute of Criminal Science and Technology,Baoshan Branch of Shanghai Public Security Bureau,Shanghai 201900,China;3.Suzhou Institute of Chinese Materia Medical,Suzhou 215006,China;4.Department of Clinical Medicine,Medical College of Soochow University,Suzhou 215123,China）

Objective To study the effects of ketamine and alcohol on learning and memory in mice and its possible mechanism.Methods Forty mice were divided into 4 groups：normal control group,ketamine group,alcohol group,and alcohol plus ketamine group.Ketamine and alcohol were given by intraperitoneal injection and intragastric administration,respectively,1 time per day,for 14 days.The ability of learning and memory in mice was tested by the method of step-down and Morris water maze.Acetylcholine（ACh）and 5-hydroxy tryptamine（5-HT）in mice brain tissue were analyzed for the possible mechanism.Results（1）Step-down：The treatment groups lessened the latency and added wrong times（P＜0.05）.The number of errors in the combined treatment group significantly increased comparing with the single drug treatment group（P＜0.05）.（2）Morris water-maze：The treatment groups prolonged the latency（P＜0.05）,reduced the target quadrant activity time significantly（P＜0.05）,and decreased the numbers of crossing the former platform significantly（P＜0.05）.（3）Biochemical index determination：The concentrations of ACh and 5-HT in treatment groups decreased significantly（P＜0.05）,showed a more decreasement comparing with the single drug treatment group.Conclusion Ketamine has a synergistic effect with alcohol on learning and memory impairment in mice,which may be related to the common inhibitive effect on the ACh and 5-HT.

forensic toxicology;ketamine;alcohol;learning;memory;mice

DF795.3

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2012.02.010

1004-5619（2012）02-0115-05

楊美玉（1984—），女，山東濟(jì)寧人，碩士研究生，主要從事法醫(yī)毒理學(xué)研究；E-mail：meiyu0307@163.com

卞士中，男，主任法醫(yī)師，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)毒理學(xué)研究；E-mail：bianshizhong@suda.edu.cn