李馮銳，周懿舒，朱蘭卉，崔洪剛，王保捷，丁 梅，龐 灝

（1.中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)血清教研室，遼寧 沈陽 110001；2.包頭醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，內(nèi)蒙古 包頭014060）

人類巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶5特異性分布及其在精細(xì)胞的表達(dá)與定位

李馮銳1，2，周懿舒1，朱蘭卉1，崔洪剛1，王保捷1，丁 梅1，龐 灝1

（1.中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)血清教研室，遼寧 沈陽 110001；2.包頭醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，內(nèi)蒙古 包頭014060）

目的 研究人類巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶5（fucosyltransferase 5，F(xiàn)UT5）的特異性分布及在精細(xì)胞的表達(dá)與定位。 方法 收集健康志愿者的精液（分離精細(xì)胞并提取精細(xì)胞膜蛋白）、陰道拭子、唾液及靜脈血，應(yīng)用免疫印跡方法檢測(cè)FUT5在人類精細(xì)胞膜、精漿、陰道液、唾液及血清中的表達(dá)量，采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)FUT5在精細(xì)胞中的表達(dá)與定位。 結(jié)果 免疫印跡方法結(jié)果顯示FUT5在精細(xì)胞膜及血清中有較高表達(dá)，但在精漿、陰道液及唾液中未被檢測(cè)到。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FUT5主要存在于精細(xì)胞頭部。表明人類精細(xì)胞膜存在一定表達(dá)量的特異性FUT5，可采用抗原-抗體反應(yīng)分離精液和陰道液混合斑中的精細(xì)胞。結(jié)論 人類FUT5表現(xiàn)出分布特異性，可應(yīng)用到法醫(yī)學(xué)性犯罪案件中混合斑的鑒定。

法醫(yī)遺傳學(xué)；精細(xì)胞；特異性；巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶類

人類巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶 5（fucosyltransferase 5，F(xiàn)UT5）是較早用于鑒定的人類巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶家族成員之一[1]，盡管對(duì)其功能及遺傳多態(tài)性的研究較為深入[2]，但是至今為止其準(zhǔn)確的分布特異性尚未完全明了。近年來的研究顯示，精細(xì)胞存在著多種特異性蛋白[3-5]，這些蛋白在精子與卵細(xì)胞特異性結(jié)合過程中發(fā)揮著重要的作用，其中的FUT5就是新近在人類精子中發(fā)現(xiàn)的一種膜內(nèi)鑲嵌糖蛋白，作為膜蛋白的FUT5可能賦予精子特有的生物學(xué)功能，并且FUT5可作為選擇性受體，協(xié)同完成精卵的識(shí)別與結(jié)合[6]。因此，存在于精細(xì)胞膜上的FUT5可考慮用蛋白免疫印跡、細(xì)胞免疫熒光等方法鑒定其特異性分布，以期應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)精斑的確證試驗(yàn)。同時(shí)根據(jù)精細(xì)胞中存在的FUT5與其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)相互作用，以及與對(duì)應(yīng)抗體結(jié)合的特性，可考慮進(jìn)行精液與陰道液混合斑中精細(xì)胞的分離，以期應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)的個(gè)人識(shí)別。為此，本研究對(duì)FUT5的特異性分布及其在精細(xì)胞的表達(dá)和定位進(jìn)行研究，為法醫(yī)學(xué)混合斑的鑒定提供新思路。

1 材料與方法

1.1 樣本

分別收集健康志愿者精液15例（精液常規(guī)參數(shù)正常），近期無性生活的健康志愿者陰道拭子5例，健康人枸櫞酸鈉抗凝靜脈血5例，健康人自然分泌的唾液5例。

1.2 試劑與儀器

RIPA裂解液（強(qiáng)）、Western及IP細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自中國碧云天生物技術(shù)公司；苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）購自美國Sigma-Aldrich公司；牛血清白蛋白購自美國Sigma-Aldrich公司；FUT5抗體 （sc-14872）、Dylight 488熒光標(biāo)記二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自美國Santa Cruz公司。

DM4000熒光顯微鏡（德國Leica公司），Image Quant RT ECL凝膠成像分析系統(tǒng)（美國GE Image Quant公司），CF16RXII高速冷凍離心機(jī)（日本Hitachi公司），SCIENTZ-IIE超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（中國新芝科技公司）。

1.3 樣本處理

15份精液樣本均各取 3 mL置于清潔無菌杯中，于37℃水浴使其液化，4℃下，以15 000×g，離心20min，分離精漿與精細(xì)胞沉淀，精漿備用，精細(xì)胞沉淀用PBS（pH=7.4）洗滌后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

陰道拭子加少許生理鹽水浸漬后在4℃下，以15000×g，離心5min，收集離心后液體備用。

抗凝靜脈血離心，在4℃下，以 1 300×g，離心15min，收集上層血清備用。

唾液無需前處理備用。

精漿、陰道液、血清及唾液用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定濃度后每管50μL分裝，-80℃保存?zhèn)錂z。

1.4 精子膜蛋白制備

取部分分離得到的精細(xì)胞沉淀物，加入50μL的Western及IP細(xì)胞裂解液，同時(shí)補(bǔ)加1mmol/L的PMSF及18 mmol/L DTT，移液器吸打混勻，使精細(xì)胞膜破壞，4℃下，以12000×g，離心5min。離心后得到的沉淀物加入50 μL的RIPA裂解液（強(qiáng)），并補(bǔ)加1 mmol/L PMSF及18 mmol/L DTT，移液器吸打混勻，冰上裂解30 min，冰浴超聲（200 W，破碎3 s，間歇12 s，共5次），使精細(xì)胞膜蛋白溶解，4℃下，以15 000×g，離心5min，收集上清液即精子膜蛋白。用BCA法測(cè)定蛋白濃度后每管50μL分裝，用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

1.5 FUT5蛋白免疫印跡分析

取人精子膜蛋白、精漿、陰道液、唾液及血清，電泳加樣的總蛋白質(zhì)量均為100 μg，經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉液（含5%脫脂奶粉的PBS）浸膜，室溫振蕩孵育60min。PBST（含0.2%Tween 20的PBS）洗膜，然后加入1∶100稀釋的抗FUT5抗體，4℃過夜。洗膜，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5000），室溫孵育60min。洗膜，然后加入ECL發(fā)光液顯色，Image Quant凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.6 精細(xì)胞FUT5的免疫熒光測(cè)定

將15例精細(xì)胞沉淀分別重新懸浮在 PBS液（pH=7.4）中，均調(diào)至精細(xì)胞濃度為1×107/mL。每例樣品取2滴精細(xì)胞懸浮液（20 μL/滴）分別做成2張涂片（1滴/張），室溫自然干燥，100%甲醇室溫固定30 min。樣本固定后，將15例樣本制作的30張涂片分為兩組，即經(jīng)過Triton-100透膜組（加入0.2% Triton-100室溫作用20 min）與不經(jīng)過Triton-100透膜組，然后用含0.2%牛血清白蛋白的PBS室溫封閉30min。洗滌載玻片后，加入1:50稀釋的抗FUT5抗體，室溫孵育60min，洗滌載玻片，加入1:400稀釋的Dylight 488熒光標(biāo)記二抗，室溫孵育60min。洗滌載玻片，用抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 FUT5蛋白免疫印跡結(jié)果

結(jié)果顯示在相對(duì)分子質(zhì)量約72000處，人精子膜蛋白裂解液及血清中出現(xiàn)陽性表達(dá)帶，而在人精漿、陰道液和唾液樣本中均未發(fā)現(xiàn)特異性的免疫反應(yīng)沉淀帶。提示人精細(xì)胞膜和血清中存在與特異性抗FUT5反應(yīng)的具有較好器官特異性的蛋白，而在精漿、陰道液和唾液中缺乏，可以考慮用于分泌物特異性的鑒定分析。

2.2 FUT5在精細(xì)胞的表達(dá)與定位

為了確定FUT5在精細(xì)胞的表達(dá)和定位，精細(xì)胞涂片后，應(yīng)用抗FUT5抗體進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果顯示，經(jīng)過0.2%Triton-100透膜處理的精細(xì)胞頭部可見綠色熒光表達(dá)的顆粒（圖1），而未經(jīng)過透膜處理的精細(xì)胞未見陽性表達(dá)。此外，在精細(xì)胞的體部和尾部也未檢測(cè)出特異性反應(yīng)的熒光。提示精細(xì)胞頭部表達(dá)一定量的FUT5，本研究所用抗FUT5抗體只識(shí)別FUT5定位于細(xì)胞膜內(nèi)的氨基酸序列。所得到的數(shù)據(jù)提示，特異性地定位于精細(xì)胞頭部的FUT5，可采用識(shí)別細(xì)胞外部氨基酸序列的FUT5抗體進(jìn)行特異性結(jié)合反應(yīng)，從而進(jìn)行精子的確證試驗(yàn)及混合斑中精細(xì)胞的分離。

圖1 人類FUT5在精細(xì)胞中的表達(dá)和定位

3討 論

蛋白質(zhì)分布顯示出的高度特異性對(duì)于法醫(yī)學(xué)鑒定具有重要的應(yīng)用價(jià)值。以往研究表明，F(xiàn)UT5在人肝、結(jié)腸及睪丸組織有不同程度表達(dá)，在T淋巴細(xì)胞、急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞（HL-60）及腦組織有微量的表達(dá)[7]，在胃癌細(xì)胞也可檢測(cè)到FUT5的表達(dá)[8]。Chiu等[6]發(fā)現(xiàn)在精子頂體細(xì)胞膜存在FUT5的表達(dá)。本研究以精液、陰道液、唾液、血清4種常見的法醫(yī)學(xué)生物檢材為研究對(duì)象，對(duì)FUT5在4種檢材中的表達(dá)進(jìn)行了研究，其中的免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果提示FUT5在精子膜蛋白及血清中有較高的表達(dá)量，而在去除精子后的精漿、陰道液、唾液中未被檢測(cè)到。人類FUT5位于19號(hào)染色體短臂（19p13.3），與FUT3和FUT6串聯(lián)構(gòu)成家族性基因簇[9]。FUT5與FUT3和FUT6除了具有相同的酶活性外，其氨基酸存在著高達(dá)90%以上的序列同源性。據(jù)報(bào)道[8-9]，F(xiàn)UT3和FUT6在血清中均有較高的表達(dá)，且FUT3、FUT5和FUT6 3種蛋白分子量極其相近，而目前商品化抗FUT5抗體對(duì)上述3種蛋白的識(shí)別缺乏特異性，因此不能排除血清樣本與FUT5抗體是否存在著非特異性反應(yīng)。進(jìn)一步的研究需選擇特異的抗FUT5抗體和針對(duì)FUT5相互作用的配體，以期解決上述難點(diǎn)。然而，陰道液和唾液中未檢測(cè)到FUT5，提示FUT5的分布具有一定的特異性。

鑒于FUT5與其家族成員FUT3、FUT6具有高度的同源性，并且以羧基端氨基酸的相似度為顯著的特性，本實(shí)驗(yàn)選用了特異性相對(duì)較高的FUT5氨基端抗體，對(duì)FUT5在精細(xì)胞的表達(dá)和定位進(jìn)行研究。依據(jù)精子膜結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，為了準(zhǔn)確地鑒定FUT5的細(xì)胞表達(dá)和定位，對(duì)精液樣品進(jìn)行了Triton-100透膜和無Triton-100透膜的處理，對(duì)于透膜后的樣本，F(xiàn)UT5抗體可透過細(xì)胞膜識(shí)別位于膜內(nèi)的氨基端，顯示出特異性的熒光顆粒位于精細(xì)胞頭部，而胞體及精細(xì)胞尾部未見特異性熒光。對(duì)于未透膜的樣本，熒光顯微鏡下整個(gè)精細(xì)胞均未見清晰的熒光顆粒。精細(xì)胞膜受體蛋白FUT5的表達(dá)量可體現(xiàn)出與卵細(xì)胞結(jié)合的程度，無疑也對(duì)受精卵的形成起到一定的作用。本研究對(duì)FUT5蛋白免疫印跡檢測(cè)時(shí)電泳加樣的總蛋白質(zhì)量為100μg，并且免疫熒光檢測(cè)到透膜后精細(xì)胞頭部熒光強(qiáng)度較弱，提示FUT5可能在精細(xì)胞中表達(dá)的量不高，推測(cè)其表達(dá)的程度可能與精子是否獲能等影響因素相關(guān)。如將FUT5作為一種精斑確證的標(biāo)記時(shí)，應(yīng)考慮選擇靈敏度高的檢測(cè)方法，例如采用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)技術(shù)并增加二抗靈敏度，以保證檢出的陽性率。

FUT5的精細(xì)胞頭部膜定位體現(xiàn)出其生理功能上的特殊意義，該特征也為FUT5作為生物學(xué)標(biāo)記應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)鑒定提供了可能性。本研究的結(jié)果顯示熒光顆粒分布在精細(xì)胞頭部的頂體部分，其余部分未見特異的熒光，提示以FUT5作為生物學(xué)標(biāo)記，不僅可以對(duì)完整的精細(xì)胞進(jìn)行良好的識(shí)別，也可對(duì)無精子尾的精細(xì)胞進(jìn)行鑒定。然而，需要指出的是FUT5蛋白羧基端的膜外定位，因其相應(yīng)的羧基端識(shí)別抗體可能與存在于體液或組織細(xì)胞中的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶家族的其他成員（主要是FUT3和FUT6）結(jié)合，實(shí)際檢驗(yàn)中將可能干擾抗FUT5抗體與精細(xì)胞的特異性反應(yīng)。而特異性識(shí)別FUT5氨基端的抗體又必須在良好透膜試劑的作用下才能完成與細(xì)胞內(nèi)特異序列的結(jié)合，否則不具膜穿透性的抗體將很難鑒定精細(xì)胞。因此，如果考慮采用抗原（精細(xì)胞上的FUT5）與抗體（抗FUT5）特異結(jié)合的方法分離精液與陰道液混合斑中精細(xì)胞時(shí)，則應(yīng)依據(jù)抗體識(shí)別的序列慎重選擇特異性高的抗FUT5。

更多精細(xì)胞膜蛋白的發(fā)現(xiàn)與分離以及對(duì)其理化特性及生物學(xué)功能的深入研究，不僅可為精斑的確證試驗(yàn)開辟新的手段，同時(shí)也將為依據(jù)抗原-抗體反應(yīng)方法分離混合斑中精細(xì)胞提供新的途徑，對(duì)法醫(yī)學(xué)檢案具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

[1]Oulmouden A，Wierinckx A，Petit JM，et al.Molecular cloning and expression of a bovine alpha（1，3）-fucosyltransferase gene homologous to a putative ancestor gene of the human FUT3-FUT5-FUT6 cluster[J].J Biol Chem，1997，272（13）：8764-8773. macology，2009，57（1）：1-7.

[10]Goulart BK，de Lima MN，de Farias CB，et al.Ketamine impairs recognition memory consolidation and prevents learning-induced increase in hippocampal brain-derived neurotrophic factor levels[J].Neuroscience，2010，167（4）：969-973.

[11]Morgan CJ，Riccelli M，Maitland CH，et al.Longterm effects of ketamine：evidence for a persisting impairment of source memory in recreational users[J]. Drug Alcohol Depend，2004，75（3）：301-308.

[12]Wang JH，F(xiàn)u Y，Wilson FA，et al.Ketamine affects memory consolidation：differential effects in T-maze and passive avoidance paradigms in mice[J].Neuroscience，2006，140（3）：993-1002.

[13]Morgado-Bernal I.Learning and memory consolidation：linking molecular and behavioral data[J].Neuroscience，2011，176：12-19.

[14]Roberts BM，Holden DE，Shaffer CL，et al.Prevention of ketamine-induced working memory impairments by AMPA potentiators in a nonhuman primate model of cognitive dysfunction[J].Behav Brain Res，2010，212（1）：41-48.

[15]Fadda F，Rossetti ZL.Chronic ethanol consumption：from neuroadaptation to neurodegeneration[J].Prog Neurobiol，1998，56（4）：385-431.

[16]段新，馬光瑜.納洛酮對(duì)東莨菪堿所致大鼠空間工作記憶障礙的影響[J].中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué)，2004，13（3）：259-260.

[17]毛健，蘇旸，陳薛釵，等.酒精處理后鼠腦內(nèi)單胺氧化酶活性及單胺神經(jīng)遞質(zhì)代謝變化的測(cè)定[J].化學(xué)通報(bào)，2010，（8）：761-764.

2011-08-06）

（本文編輯：張欽廷）

Distribution Specificity of Human Fucosyltransferase 5 and Its Expression and Localization in Spermatids

LI Feng-rui1,2,ZHOU Yi-shu1,ZHU Lan-hui1,CUI Hong-gang1,WANG Bao-jie1,DING Mei1,PANG Hao1
（1.Department of Forensic Serology,School of Forensic Medicine,China Medical University,Shenyang 110001, China;2.Department of Forensic Medicine,Baotou Medical College,Baotou 014060,China）

Objective To investigate distribution specificity of human fucosyltransferase 5（FUT5）as well as its expression and localization in spermatids.Methods Human semen,vaginal swab,saliva and venous blood from healthy individuals were collected.The spermatids were isolated and the spermatid membrane protein was then extracted.Expression levels of FUT5 from human spermatid membrane,seminal plasma, vaginal fluid,saliva and serum were detected by immunoblotting technique.The expression and localization of FUT5 in spermatids were analyzed by immunofluorescent method.Results Immunoblotting technique showed that FUT5 was expressed on spermatid membranes and in serum,but not in seminal plasma,vaginal fluid and saliva.The expressed FUT5 on spermatids was mostly localized on head of spermatids by fluorescent microscopy,suggesting that there was certain amount of FUT5 on human spermatid membrane, and the spermatids might be isolated from mixed stains with vaginal fluid by antigen-antibody reaction. Conclusion Human FUT5 shows a characteristic distribution specificity,and this feature may be used for identification of mixed stain involved in criminal sexual offence in future forensic practice.

forensic genetics;spermatids;specificity;fucosyltransferases

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2012.02.009

1004-5619（2012）02-0112-03

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（20102104 110021）

李馮銳（1981—），女，內(nèi)蒙古包頭人，博士研究生，主要從事法醫(yī)物證學(xué)研究；E-mail：rui6826@yahoo.com.cn

龐灝，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)物證學(xué)研究；E-mail：panghao8@gmail.com