梁碧華 李潤祥 馬少吟 龔業(yè)青 李薇 畢超 朱慧蘭 廣東省廣州市皮膚病防治所,廣東廣州 510095
CD 20嵌合抗體的構(gòu)建、表達(dá)及純化的實驗研究
梁碧華 李潤祥 馬少吟 龔業(yè)青 李薇 畢超 朱慧蘭 廣東省廣州市皮膚病防治所,廣東廣州 510095
目的構(gòu)建CD20嵌合抗體,檢測其活性并純化該嵌合抗體。方法從雜交瘤細(xì)胞株中分別擴(kuò)增抗鼠CD20抗體的輕鏈和重鏈基因的可變區(qū),并與人的輕鏈和重鏈恒定區(qū)連接,分別克隆到pTY5真核表達(dá)載體,然后共轉(zhuǎn)染293E細(xì)胞,通過RT-PCR檢測mRNA的轉(zhuǎn)錄,夾心ELISA檢測抗體表達(dá)量,流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析嵌合抗體的結(jié)合特異性。結(jié)果正確擴(kuò)增得到抗CD20人鼠嵌合抗體的輕鏈和重鏈基因片段并成功構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pTY5-CD20H和pTY5-CD20L,在293E細(xì)胞中進(jìn)行瞬時表達(dá),RT-PCR顯示抗體基因在細(xì)胞中進(jìn)行了成功的轉(zhuǎn)錄,ELISA測定抗體表達(dá)量在15~24 ng/mL之間,流式檢測結(jié)果證實細(xì)胞上清分泌的抗CD20嵌合抗體可與NS-1細(xì)胞株結(jié)合,并通過protein A柱親和層析獲取高純度的抗CD20嵌合抗體。結(jié)論成功構(gòu)建表達(dá)抗CD20嵌合抗體的載體,且表達(dá)的抗體具有結(jié)合活性,為下一步研究慢性蕁麻疹的發(fā)病機(jī)制及治療打下基礎(chǔ)。
CD20;嵌合抗體;慢性蕁麻疹;自身免疫疾病
CD20抗原是一種B細(xì)胞分化抗原,僅位于前B細(xì)胞和成熟B細(xì)胞,而在造血干細(xì)胞、血漿細(xì)胞和其他正常組織中不表達(dá)[1],是B細(xì)胞靶向治療的理想作用位點??笴D20單克隆抗體(mAb)以B細(xì)胞表面分子CD20為靶向,其用于治療B細(xì)胞淋巴瘤已經(jīng)獲得了令人鼓舞的療效[2]。近年來也越來越多地應(yīng)用到自身免疫性疾病的治療,包括慢性蕁麻疹(chronic urticaria,CU)的治療[3]。
慢性蕁麻疹是一種常見皮膚病,目前治療效果不佳,且其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,至今尚未完全清楚[4-8]。雖有研究表明將B細(xì)胞靶向治療應(yīng)用于慢性蕁麻疹具有良好療效[9-11],但目前資料有限,對于具體的作用機(jī)制尚不清楚。為了尋找更為有效安全的用于治療慢性蕁麻疹的CD20抗體藥物,本研究在前期篩選獲取抗CD20單克隆細(xì)胞株的基礎(chǔ)上,擬克隆其重鏈和輕鏈的基因片段,構(gòu)建重組真核表達(dá)載體,并最終表達(dá)、純化具有細(xì)胞結(jié)合活性的抗CD20嵌合抗體,為下一步治療慢性蕁麻疹的研究打下基礎(chǔ)。
1.1 實驗材料
雜交瘤細(xì)胞株、TOP10(大腸埃希菌)、293E細(xì)胞、NS-1細(xì)胞為本實驗室保存。
RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒購自美國Promega公司;質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購于康為世紀(jì)公司;DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、Ex Taq酶、DNA Marker購于大連寶生物公司;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基購自Invitrogen公司;改良型快速雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基購自PAA公司;FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體購自美國Santa Cruz公司;protein A層析柱購自杭州賢至生物科技有限公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 引物設(shè)計參考文獻(xiàn)報道[12-13]設(shè)計合成針對鼠輕、重鏈可變區(qū)序列的引物;根據(jù)Genebank檢索得到的抗體κ和IgG1型基因序列設(shè)計合成針對輕、重鏈恒定區(qū)的引物,見表1。
表1 PCR引物
1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)于改良型快速雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中;293E細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中,NS-1細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中,均含10%胎牛血清和雙抗;培養(yǎng)于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中。
1.2.3 RNA提取與cDNA合成分別收集雜交瘤細(xì)胞和293E細(xì)胞,按TRIZOL的說明書進(jìn)行提取細(xì)胞總RNA,測OD值和電泳檢測RNA質(zhì)量,按RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得cDNA,保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>
1.2.4 抗體輕、重鏈基因的調(diào)取與克隆以來源于雜交瘤細(xì)胞的cDNA為模板,用引物VL-F和VL-R、VH-F和VH-R分別擴(kuò)增輕、重鏈可變區(qū)基因;以來源于293E細(xì)胞的cDNA為模板,用引物CL-F和CL-R、CH-F和CH-R分別擴(kuò)增輕、重鏈恒定區(qū)基因。上述序列測序驗證正確后,通過重疊延伸PCR,連接可變區(qū)和恒定區(qū),得到完整抗體基因。再次測序驗證,然后將輕、重鏈基因用內(nèi)切酶Eco RI、Bam HI分別進(jìn)行雙酶切,分別克隆到用同樣酶進(jìn)行雙酶切的載體pTY5中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞,于平板(氨芐抗性)37℃過夜培養(yǎng)后,分別挑取單克隆菌株鑒定測序。構(gòu)建好的重組表達(dá)載體分別命名為pTY5-CD20H和pTY5-CD20L。
1.2.5 轉(zhuǎn)染和鑒定轉(zhuǎn)染前1天接種細(xì)胞:用胰酶消化293E細(xì)胞后,調(diào)細(xì)胞濃度為2.5×105個/mL,每孔1.0mL接種24孔板,置37℃含5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁生長達(dá)到底面積70%。轉(zhuǎn)染按Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量為1μg,培養(yǎng)4 h后更換DMEM培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,然后收集細(xì)胞提取RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,PCR鑒定抗體基因轉(zhuǎn)錄情況。
1.2.6 蛋白表達(dá)純化及初步測定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293E細(xì)胞,搖瓶培養(yǎng),4~7 d收獲培養(yǎng)基上清,ProteinA柱純化抗體。操作方法參照說明書進(jìn)行,純化后用分光光度計測OD值推算濃度,以SDA-PAGE測定蛋白的純度、分子量。
1.2.7 嵌合抗體表達(dá)的ELISA檢測以羊抗人κ多抗于4℃包被酶標(biāo)板過夜,用含1%BSA的PBST在37℃進(jìn)行封閉2 h。分別加入嵌合抗體的表達(dá)上清和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的上清,以人IgG參考品作為陽性對照。37℃孵育30min后用PBST洗5次,再加入HRP標(biāo)記的羊抗人Fc抗體,37℃孵育30 min后用PBST洗5次。再加入TMB顯色,酶標(biāo)儀讀取450 cm及630 cm雙波長讀數(shù)。
1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測抗體結(jié)合活性收集NS-1細(xì)胞,每管5×105個,用PBS洗1遍,離心收集細(xì)胞;各管加表達(dá)抗體,室溫反應(yīng)1 h,設(shè)置陰性對照;離心收集細(xì)胞,用PBS洗1遍,加二抗FITC-羊抗小鼠IgG(1∶500),室溫避光反應(yīng)1 h;離心收集細(xì)胞,用PBS洗1遍,各管用300μL PBS重懸,上機(jī)檢測。
2.1 抗體基因的克隆
PCR結(jié)果見圖1,擴(kuò)增大小正確,測序驗證后,序列顯示為抗體基因。克隆到表達(dá)載體后,雙酶切鑒定無誤,結(jié)果見圖2。測序結(jié)果顯示,所克隆片段為鼠輕鏈可變區(qū)加人輕鏈恒定區(qū),所調(diào)取抗體恒定區(qū)輕鏈為κ型;另一片段為鼠重鏈可變區(qū)加人重鏈恒定區(qū),所調(diào)取抗體恒定區(qū)重鏈為IgG1型。
2.2 抗體基因的表達(dá)鑒定
將克隆有抗體輕、重鏈基因的表達(dá)載體同時轉(zhuǎn)染進(jìn)293E細(xì)胞,然后收集細(xì)胞提取RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后用特異的引物進(jìn)行PCR鑒定。PCR結(jié)果顯示能特異擴(kuò)增目的片段,見圖3。這說明攜帶抗體輕、重鏈基因的表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染進(jìn)293E細(xì)胞,并能表達(dá)抗體基因。
2.3 表達(dá)蛋白的純化和測定
收集上清約180mL進(jìn)行純化,純化后體積為2.7mL。根據(jù)分光光度計所測OD值估算蛋白濃度為200μg/mL左右。用protein A柱能純化出蛋白,即說明此蛋白能與protein A親和柱結(jié)果,可判定其為抗體類物質(zhì)。在還原條件下的SDSPAGE結(jié)果請見圖4,顯示有2條帶,分子量約為23 kDa和51 kDa,與本研究設(shè)計的輕重鏈分子量相符合,表明成功獲得了蛋白質(zhì)為IgG1型的完整抗體分子。
2.4 抗體ELISA含量的測定
轉(zhuǎn)染3 d后,夾心ELISA測定上清中嵌合抗體的含量,通過與陽性參考品比較,上清中抗體的含量在15~24 ng/mL之間。
2.5 表達(dá)抗體的結(jié)合活性
流式檢測結(jié)果請見圖5,結(jié)果表明共轉(zhuǎn)染了嵌合基因的細(xì)胞培養(yǎng)上清能與NS-1細(xì)胞結(jié)合,具有親本鼠源抗體結(jié)合效果。這表明所表達(dá)的嵌臺抗體具有正確的抗原結(jié)合特性,并且含有人抗體恒定區(qū)序列。
慢性蕁麻疹病因多樣復(fù)雜,發(fā)病機(jī)制不清楚,治療相對比較困難,嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[4-8]。目前治療慢性蕁麻疹的藥物很多,但療效不佳[14-15]。目前已有研究表明抗CD20單克隆抗體治療慢性蕁麻疹具有良好療效[9-11],但具體作用機(jī)制還有待研究。
CD20是非糖基化的Ⅲ型跨膜蛋白,具有高度保守性,位于B淋巴細(xì)胞表面,是B淋巴細(xì)胞表面分化抗原[16]。它主要參與調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞的增殖與分化,在免疫系統(tǒng)起重要作用。而B細(xì)胞在蕁麻疹的發(fā)病中起著關(guān)鍵作用,抗CD20單克隆抗體通過靶向治療而清除B細(xì)胞,可能通過干擾B細(xì)胞所發(fā)揮的功能而達(dá)到免疫抑制作用,從而緩解蕁麻疹癥狀[3]。Arkwright[9]首次報道利用利妥昔單抗成功治療嚴(yán)重慢性自身免疫性蕁麻疹1例,不過其報道同時認(rèn)為此單抗可能不適用于物理性蕁麻疹患者的治療。Mukhtyar等[10]也報道成功治療1例難治性蕁麻疹性血管炎。而Murota等[11]報道1例Schnitzler綜合征并發(fā)B細(xì)胞淋巴瘤患者在接受利妥昔單抗和放射療法聯(lián)合治療后,在淋巴瘤癥狀改善后蕁麻疹癥狀也逐步得到改善。這些研究均提示B細(xì)胞在蕁麻疹發(fā)病中的重要作用,但更深入的研究還有待進(jìn)行。
與鼠抗相比,嵌合抗體既保留了鼠源可變區(qū)的高親和性,又具有人Fc段的多種免疫殺傷功能,降低了人抗鼠抗體反應(yīng)的發(fā)生率,改善了臨床治療效果[17-18]。與其他小分子基因工程抗體相比,嵌合抗體作為完整抗體分子,在體內(nèi)半壽期更長,并具有人Fc段的多種免疫殺傷功能[19-20]。本研究成功構(gòu)建了含鼠源可變區(qū)和人源恒定區(qū)的抗體基因,在293E細(xì)胞中進(jìn)行瞬時表達(dá)后,RT-PCR顯示抗體基因在細(xì)胞中進(jìn)行了成功的轉(zhuǎn)錄,ELISA測定抗體表達(dá)量在15~24 ng/mL之間,流式檢測結(jié)果證實細(xì)胞上清分泌的抗CD20嵌合抗體可與NS-1細(xì)胞株結(jié)合,并通過protein A柱親和層析獲取高純度的抗CD20嵌合抗體,可用于進(jìn)一步研究抗抗CD20單克隆抗體治療慢性蕁麻疹的療效和機(jī)制的實驗。
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Experimental study of construction,expression,and purification of CD20 chimeric antibody
LIANG Bihua LIRunxiang MA Shaoyin GONG Yeqing LIWei BIChao ZHU Huilan
Guangzhou Institute of Dermatology,Guangdong Province,Guangzhou 510095,China
ObjectiveTo construct CD20 chimeric antibody and test its activity and purify it.MethodsLight chain gene's and heavy chain gene's variable regions from rat anti-CD20 antibody were amplified from hybridoma cell strains respectively,and were connected with invariable regions of human's light chain and heavy chain.After that,they were cloned to pTY5 eukaryotic expression vector,and then to transfection of 293E cell.Transcription ofmRNA,antibody expression,and binding specificity of chimeric antibody were tested by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)and sandwich enzyme-linked immuno sorbent assay(ELISA),and analyzed by flow cytometry(FCM)correspondingly.ResultsLight chain gene segment and heavy chain gene segment of human-rat chimeric antibody from CD20 antibody were correctly amplified,which also successfully constructed recombination eukaryotic expression vectors of pTY5-CD20H and pTY5-CD20L who could express instantaneously in 293E cell.RT-PCR revealed antibody gene′s transcription in cellswas successful.Through ELISA determination,quantity of antibody expression was between 15-24 ng/mL.Flow cytometry confirmed that anti-CD20 chimeric antibody from secretion of supernatant could bind with NS-1 cell strain.High purity of anti-CD20 chimeric antibody could be obtained through protein A column affinity chromatography.ConclusionSuccessful construction of expression anti-CD20 chimeric antibody's vector and expressed antibody with bound activity lay a foundation for next study of pathogenesis and treatmentof chronic urticaria.
CD20;Chimeric antibody;Chronic urticaria;Autoimmune disease
R593
A
1673-7210(2012)11(b)-0010-04
廣東省廣州市科技支撐計劃項目(項目編號:2009Z1-E011)。
朱慧蘭(1966.9-),女,中共黨員,主任醫(yī)師,碩士生導(dǎo)師,廣州市衛(wèi)生局局管優(yōu)秀科技人才,現(xiàn)任廣州市皮膚病防治所副所長,主要從事皮膚病方面的研究。
2012-04-25 本文編輯:衛(wèi)軻)