呂子明 劉文娟 王 永 劉曉燕 梁俊清 屠鵬飛

1.北京大學(xué)藥學(xué)院 天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191；2.北京以嶺藥業(yè)有限公司，北京 100027

黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.、三角葉黃連Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao、云連 Coptis teeta Wall.等的干燥塊莖，具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效[1]。黃連中的小檗堿、巴馬亭、黃連堿、小檗堿等生物堿是其發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)旨在優(yōu)選出一種適合分離黃連總生物堿的大孔樹(shù)脂，并對(duì)優(yōu)選出的大孔樹(shù)脂分離黃連總生物堿時(shí)的工藝條件及參數(shù)進(jìn)行研究。

1 儀器與材料

UV-2550紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；Agilent 1100 Series高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；Sartorius BS 110電子天平；黃連（購(gòu)于河北省安國(guó)以嶺飲片有限公司，經(jīng)鑒定，符合《中國(guó)藥典》2010年版一部標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)地：四川，批號(hào)：070401）；小檗堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110713-200208）；大孔吸附樹(shù)脂 S-8、DM130（三星樹(shù)脂科技有限責(zé)任公司），HPD-600、HPD-400A、HPD-700、AB-8、D101（滄州寶恩吸附材料科技有限公司），D141、D4020（天津市波鴻建材化工樹(shù)脂有限公司），其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 上柱藥液的制備

按文獻(xiàn)[2]中優(yōu)化好的提取工藝進(jìn)行提取。取黃連飲片適量，加50%乙醇，溶劑用量8倍，提取3次，每次1.5 h。合并提取液，減壓濃縮至無(wú)醇味，加水定容至2 500 mL，抽濾，備用，即每毫升藥液相當(dāng)于含30 mg生藥材。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 總生物堿的含量測(cè)定 依據(jù)文獻(xiàn)[2]，采用紫外分光光度法進(jìn)行。

2.2.2 小檗堿的含量測(cè)定[2]依據(jù)文獻(xiàn)[2]，采用高效液相法進(jìn)行。色譜條件：Phenomenex C18柱（250 mm × 4.6 mm，0.5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-磷酸水溶液緩沖鹽[磷酸-三乙胺-水（1∶2∶100）]（24∶76）；柱溫：室溫；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：345 nm；進(jìn)樣量：5 μL。

2.3 大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理

取各型號(hào)樹(shù)脂于95%乙醇漂洗干凈，浸泡24 h后，濕法裝柱，并用95%乙醇動(dòng)態(tài)洗脫5倍樹(shù)脂體積，水洗至無(wú)醇味，依次用5%鹽酸（浸泡6 h后，水洗至中性）和5%氫氧化鈉（浸泡6 h后，水洗至中性）處理，最后用95%乙醇動(dòng)態(tài)洗脫至流出液加水（體積比1∶5）不變混濁為止，用水置換出乙醇后備用。

2.4 大孔吸附樹(shù)脂的篩選

分別量取25 mL各種樹(shù)脂，徑高比=1∶10，上樣濃度為30 mg/mL（藥材量/水液量），上樣流速為3 BV/h。檢測(cè)方法：按照文獻(xiàn)[1]中黃連藥材標(biāo)準(zhǔn)“鑒別”項(xiàng)下TLC法檢測(cè)漏液點(diǎn)，每5 mL流出液檢測(cè)一次，記錄上樣量，確定上樣終點(diǎn)。S-8、HPD-600、HPD-400A、DM130、D141、AB-8、HPD-700、D101、D4020型樹(shù)脂的上液量分別為10、35、100、90、175、140、120、130、110 mL。結(jié)果表明，弱極性（HPD-400A、DM130）和非極性樹(shù)脂（D141、AB-8、HPD-700、D101、D4020）用于黃連總生物堿的吸附效果較好，極性樹(shù)脂吸附效果差（S-8、HPD-600）； 因此選擇吸附量較高的 D-141、AB-8、HPD-700、D1014型樹(shù)脂進(jìn)一步試驗(yàn)。

對(duì)選出的 D-141、AB-8、HPD-700、D101 四個(gè)型號(hào)的樹(shù)脂進(jìn)行考察?？疾旆椒ǎ翰捎脛?dòng)態(tài)法試驗(yàn)，飽和吸附上樣；樹(shù)脂用量 25 mL，徑高比=1∶10；上樣濃度 30 mg/mL，吸附流速2 BV/h；上樣完畢后用2倍水洗柱；用70%乙醇（預(yù)試驗(yàn)選定）作洗脫液，洗脫10倍量柱體積，洗脫的流速均為2 BV/h。收集各70%乙醇洗脫液、各吸附流出液、水洗液。

測(cè)定及分析結(jié)果顯示，測(cè)定上樣液、過(guò)柱后的流出液、70%醇洗脫液及水液中的總生物堿和小檗堿的含量，計(jì)算出各樹(shù)脂的最大吸附量及最大洗脫量，從而選出最佳樹(shù)脂，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樹(shù)脂型號(hào)篩選結(jié)果

由表1結(jié)果表明，D-141的飽和吸附量最高，除D-141的洗脫率稍低外，其他3種樹(shù)脂的洗脫率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此選用D-141為純化樹(shù)脂。

2.5 吸附過(guò)程參數(shù)考察

2.5.1 上樣濃度的考察 將不同濃度的樣品溶液（60、40、30、15 mg/mL）分別通過(guò)濕體積為25 mL的D-141樹(shù)脂柱，以2 BV/h的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附。按照文獻(xiàn)[1]中黃連藥材標(biāo)準(zhǔn)“鑒別”項(xiàng)下TLC法檢測(cè)漏液點(diǎn)，每5 mL流出液檢測(cè)1次，記錄上樣量，確定上樣終點(diǎn)。結(jié)果上樣體積分別為75、140、165、250 mL； 總生物堿吸附量分別為 444.38、541.80、540.54、381.75 mg。由結(jié)果可知，當(dāng)上樣濃度大于40或小于30 mg/mL時(shí)樹(shù)脂的吸附量變低，在30～40 mg/mL范內(nèi)吸附量大，因此確定此范圍為上樣液濃度范圍。

2.5.2 吸附流速考察 選取 4個(gè)吸附速度， 即1、2、3、4 BV/h進(jìn)行考察。考察方法：上樣濃度30 mg/mL，其他同上樣濃度考察試驗(yàn)。結(jié)果測(cè)定及分析同“2.5.1”項(xiàng)下內(nèi)容。結(jié)果是上樣體積分別為 175、175、175、165 mL。 結(jié)果表明，1、2、3、4 BV/h四個(gè)上樣速度下的樹(shù)脂吸附量相同，差別無(wú)顯著性。從吸附量穩(wěn)定性及較短吸附時(shí)間的角度考慮，選擇2 BV/h的吸附速度上樣。

2.6 洗脫過(guò)程各參數(shù)考察

2.6.1 水洗（除雜）體積考察 進(jìn)行三根柱平行試驗(yàn)，按上述試驗(yàn)確定的條件進(jìn)行上樣和吸附；三根柱的水洗體積分別為1、2、3倍的柱體積，水洗流速為3 BV/h。測(cè)定上樣液、各水洗液中的總生物堿量，及上樣液和各水洗液的烘干后的干膏重；計(jì)算各倍數(shù)水洗液中的總生物堿量占上樣液總生物堿量的百分比，及水洗液中的總生物堿量占各自水洗干膏重的百分比。結(jié)果表明，3倍水洗時(shí)洗下的生物堿量大，除雜液中的生物堿含量超過(guò)了50%，而2倍水洗流失的生物堿量低，除雜液中的生物堿含量低于30%，因此選擇2倍水洗除雜。

2.6.2 洗脫乙醇濃度的考察 對(duì) 20%、30%、40%、50%、60%、70%六種乙醇濃度進(jìn)行了考察?？疾旆椒ǎ浩叫羞M(jìn)行6根柱的吸附洗脫；樹(shù)脂用量及徑高比同上樣濃度試驗(yàn)；吸附、水洗工藝按優(yōu)選工藝參數(shù)進(jìn)行；醇洗速度為3 BV/h，醇洗體積為10倍柱體積。收集各醇洗液于500 mL量瓶中，加洗脫醇稀釋至刻度，搖勻。測(cè)定及分析結(jié)果顯示，測(cè)定各洗脫液中及上樣液的小檗堿含量、總生物堿含量及各洗脫液的干膏重，計(jì)算小檗堿、生物堿的洗脫收率及總生物堿在洗脫液干膏中的重量百分比。見(jiàn)表2。

小檗堿洗脫百分率=洗脫液中小檗堿的量/上樣液的小檗堿量×100%。

表2 洗脫乙醇濃度考察結(jié)果

干膏中生物堿百分含量=洗脫液中總生物堿的量/各洗脫液的干膏量×100%。

由表2結(jié)果可知，40%、50%兩濃度乙醇對(duì)總生物堿、小檗堿的洗脫率高，洗脫液的純度也適宜，選擇50%的乙醇為洗脫溶媒。

2.6.3 洗脫溶劑用量的考察

對(duì)4、6、8、10、12倍柱體積的50%乙醇用量進(jìn)行了考察?？疾旆椒ǎ簶?shù)脂用量及徑高比同上樣濃度試驗(yàn)；吸附、水洗工藝按優(yōu)選工藝參數(shù)進(jìn)行；醇洗速度為3 BV/h，進(jìn)行12倍柱體積的洗脫，依次收集4、6、8、10、12倍時(shí)的洗脫液。結(jié)果測(cè)定及分析：測(cè)定各洗脫液中及上樣液的總生物堿含量，計(jì)算各洗脫液中的生物堿占上樣總生物堿的百分比，結(jié)果分別為93.15%、0.50%、0.14%、0.04%、0.02%。 由結(jié)果可知，4倍量50%乙醇洗脫可洗脫93%的上樣量，而后邊的2倍僅洗掉的量?jī)H為0.5%，且后邊的8、10、12倍的洗脫量均依次遞減。因此選擇4倍柱體積洗脫。

2.6.4 洗脫流速的考察 對(duì)2、3、4 BV/h的流速進(jìn)行考察。平行進(jìn)行3根柱的吸附洗脫；樹(shù)脂用量及徑高比同上樣濃度試驗(yàn)；吸附、水洗工藝按優(yōu)選工藝參數(shù)進(jìn)行；醇洗速度為依次為設(shè)定的3個(gè)流速，洗脫體積為4 BV，分別收集3種流速的洗脫液。結(jié)果測(cè)定及分析：測(cè)定各洗脫液中及上樣液的總生物堿含量，計(jì)算各洗脫液中的生物堿占上樣總生物堿的百分比，結(jié)果分別為見(jiàn)93.58%、93.39%、91.90%。由結(jié)果可知，2、3倍的洗脫流速時(shí)生物堿洗脫百分率較高，4倍稍低，從保證洗脫效果和縮短洗脫時(shí)間的角度考慮，選擇3 BV/h的洗脫流速。

2.6.5 徑高比考察 選擇 1∶6、1∶8、1∶10、1∶12 四種徑高比的樹(shù)脂柱進(jìn)行考察。吸附、水洗、洗脫過(guò)程均按優(yōu)選的工藝參數(shù)進(jìn)行，收集各洗脫液。測(cè)定各洗脫液中及上樣液的總生物堿含量，計(jì)算各洗脫液中的生物堿占上樣總生物堿的百分比，結(jié)果分別為93.09%、94.53%、94.22%、95.87%。表明，隨著徑高比的變大，洗脫率有增大的趨勢(shì)，但差別不是很大，考慮生產(chǎn)上方便實(shí)用的原則，選擇適宜的徑高比為1∶8。

2.7 樹(shù)脂使用次數(shù)考察

具體的考察方法為每次的純化洗脫過(guò)程按純化工藝考察優(yōu)化好的吸附、洗脫方法進(jìn)行。樹(shù)脂用量為30 mL，收集各洗脫液。樹(shù)脂首次處理方法同“2.3”項(xiàng)，每次洗脫完畢后的樹(shù)脂處理方法為50%乙醇洗脫8倍體積，再用95%乙醇洗脫4倍體積。進(jìn)行了10次試驗(yàn)。結(jié)果測(cè)定及分析：測(cè)定上柱液、各次洗脫液中的總生物堿量，計(jì)算洗脫百分比。結(jié)果洗脫百分比分 別 95.21% 、95.29% 、95.62% 、96.78% 、95.38% 、95.46% 、94.96%、95.29、95.08、95.13%。樹(shù)脂重復(fù)使用 10 次，吸附、洗脫性能未有降低，說(shuō)明樹(shù)脂應(yīng)用于本品的純化具良好的耐用性。

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn)

按上述所確定的吸附和洗脫條件，即平行制備3批樣品，測(cè)定總生物堿和小檗堿的解吸率以及總生物堿含量。總生物堿的解吸率分別為94.44%、94.76%、93.56%；小檗堿的解吸率分別為92.86%、93.48%、92.43%。醇洗物中總生物堿的含量為67.67%、68.01%、67.45%，平均值為67.71%。說(shuō)明所得工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道多采用酸沉法純化黃連總生物堿，但是此方法在實(shí)際生產(chǎn)操作中對(duì)人體和環(huán)境有較大影響。近些年來(lái)，大孔樹(shù)脂在中草藥化學(xué)成分純化得到了廣泛的應(yīng)用。作者在參考多篇文獻(xiàn)[3-8]的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了本文的實(shí)驗(yàn)完善。確定大孔吸附樹(shù)脂純化黃連總生物堿的工藝即：選擇D-141大孔吸附樹(shù)脂，上樣藥液濃度為30 mg藥材/mL，徑高比為1∶8，吸附流速為2 BV/h，除雜溶劑為水，除雜體積為2 BV，除雜流速為1 BV/h，洗脫溶劑為50%乙醇，洗脫體積為4 BV，洗脫流速為3 BV/h。該工藝合理、可行，適合工業(yè)生產(chǎn)。

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