陳利鋒 趙映前 劉建忠 胡愛(ài)萍

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北武漢 430065；2.湖北省中醫(yī)院，湖北武漢 430070

肝干細(xì)胞是體內(nèi)存在的一種具有自我增殖能力和多向分化潛能的干細(xì)胞，可以分化為肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞。肝干細(xì)胞可參與肝臟的修復(fù)與重建，也是肝細(xì)胞移植、生物人工肝的重要細(xì)胞來(lái)源。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)肝干細(xì)胞移植對(duì)急慢性肝臟疾病有明確的治療作用，使得肝干細(xì)胞的研究成為熱點(diǎn)[1-2]。研究中選用西洋參、牛黃配伍，具有“益氣養(yǎng)陰、清熱解毒”之功，現(xiàn)代藥理研究證明牛黃、西洋參在改善肝功能、降低轉(zhuǎn)氨酶、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等方面具有很好療效，但對(duì)肝干細(xì)胞的作用尚不十分清楚[3]。本實(shí)驗(yàn)研究不同濃度牛黃參含藥血清對(duì)大鼠肝干細(xì)胞系WB-F344的增殖、誘導(dǎo)分化作用，觀察在誘導(dǎo)分化過(guò)程中細(xì)胞因子受體表達(dá)的變化，探討牛黃、西洋參復(fù)方對(duì)肝干細(xì)胞增殖、分化的影響，進(jìn)一步揭示益氣解毒法對(duì)WB-F344細(xì)胞的作用機(jī)制。

1 材料與試藥

1.1 動(dòng)物

48只 SPF級(jí)雄性 Wistar大鼠，體重 180～200 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，許可證號(hào)SCXK（鄂）2008-0005。鼠肝干細(xì)胞系WB-F344購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司。

1.2 試藥

體外培育牛黃、西洋參、牛黃參膠囊均由武漢健民大鵬藥業(yè)有限公司提供。DMEM高糖液體培養(yǎng)基（HYCLONE），10%滅活的特優(yōu)級(jí)胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），無(wú)菌磷酸鹽（PBS）緩沖液（武漢博士德），青霉素、鏈霉素雙抗（西化儀北京科技有限公司）。胰蛋白酶、MTT、DMSO（美國(guó)GIBCO公司分裝）。地塞米松磷酸鈉注射液（湖北天藥藥業(yè)股份有限公司），胰島素（安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司），Trizol（總RNA抽提劑）、一抗稀釋液及二抗稀釋液（碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn)），上、下游引物（BIONEER），F(xiàn)ermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó) MBI）。 HGF、EGF（美國(guó)派普泰克公司）。 兔抗鼠的 HGFR、EGFR 多克隆抗體、兔抗鼠的 TGFβR1、TGFβR2多克隆抗體（美國(guó)BIOWORLD公司），羊抗鼠的EGF多克隆抗體（美國(guó)SANTA CRUZ公司），辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記的兔抗羊抗體和山羊抗兔的二抗（美國(guó)BIOWORLD公司）?？捡R斯亮藍(lán)G-250、考馬斯亮藍(lán)R-250、Tween-20（武漢華順生物科技有限公司），預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白Marker（FERMENTAS 公司）、麗春紅 S（SIGMA 分裝），TBS 緩沖液（10×）（BIOSHARP公司），ECL發(fā)光試劑盒（美國(guó)SANTA CRUZ公司），無(wú)水乙醇、甲醇、氯仿、異丙醇、苯酚（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），牛血清白蛋白（武漢市貝爾生物技術(shù)有限公司）。GAPDH（上?？党缮锕こ逃邢薰荆?。

2 方法與結(jié)果

2.1 含藥血清的制備

將大鼠分為空白組、水煎組、成分組，水煎組與成分組互為對(duì)照，每組各16只。體外培育牛黃、西洋參配伍組采用傳統(tǒng)水煎法灌胃動(dòng)物制作含藥血清（水煎組）；牛黃參膠囊是由西洋參和天然牛黃的替代品體外人工培育牛黃組方而成，取粉稀釋使用灌胃動(dòng)物制作含藥血清（成分組）。各組給相應(yīng)的藥物連續(xù)灌胃7 d（1次／d），給藥濃度為：含牛黃生藥濃度3.6 g/L，含西洋參生藥濃度21.6 g/L，大鼠按體重100 g灌胃1 mL的量給藥，空白組灌胃等量的生理鹽水，連續(xù)1周，末次給藥后2 h進(jìn)行大鼠頸動(dòng)脈取血，將采集的血液在室溫中靜置 4 h，3 000 r/min，離心 15 min，將收集的血清在 56℃水浴30 min進(jìn)行滅活，而后過(guò)濾除菌，分裝成小瓶于-20℃保存?zhèn)溆茫枰獣r(shí)用培養(yǎng)液配制成不同濃度的含藥血清。

2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)

用50 mL的培養(yǎng)瓶，將WB-F344接種于含10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素及鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/mL，置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞換液時(shí)間為2～3 d，3～5 d傳代，0.25%胰蛋白酶消化后1∶2傳代。

2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期WB-F344細(xì)胞用胰酶消化，調(diào)密度為1×105/mL，按每孔100 μL接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。于37℃、5%CO2條件下，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，分別加入濃度為5%、10%、20%的成分組與水煎組藥物血清，空白對(duì)照組加入5%、10%、20%的正常大鼠血清，正常對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)液，以上每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行孔，作用 24 h，每孔再加入 5 mg/mL MTT 25 μL，4 h 后棄上清液，加入DMSO 125 μL/孔，振蕩5 min左右，置于酶標(biāo)儀上490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度OD值。

2.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞因子及受體的表達(dá)

以1×105/mL密度接種WB-F344細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)，無(wú)血清同步化24 h，加入10%成分組和水煎組的藥物血清干預(yù)，24 h裂解收集細(xì)胞，再加入細(xì)胞裂解液冰面上裂解20 min，離心處理后收集上清即得總蛋白樣品。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白濃度，去離子水稀釋蛋白濃度至2.5 μg/μL，按照每孔上樣總蛋白的量50 μg，每條泳道上樣20 μL。在進(jìn)行SDS-PAGE電泳之前，需將配好的蛋白樣品置入95℃加熱5 min使蛋白變性。制備凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，加入封閉液37℃封閉1 h。封閉完畢后，用TBST洗滌液洗滌膜條3次，每次10 min。1∶1 000稀釋一抗，低溫孵育過(guò)夜。一抗孵育完畢后，用TBST洗滌液洗滌膜條3次，每次10 min。1∶500稀釋二抗，37℃孵育2 h，應(yīng)用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光法顯影，曝光洗片，Band scan分析膠片灰度值。

2.5 RT-PCR檢測(cè)ALB mRNA的表達(dá)

取密度為5×103/孔WB-F344細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，8 h后換分化培養(yǎng)體系（高糖DMEM、10%胎牛血清、HGF 50 ng/mL、EGF 20 ng/mL、胰島素 1 μg/mL、地塞米松 1 μmol/L），加入10%成分組和水煎組的含藥血清，并設(shè)正常對(duì)照孔和空白血清對(duì)照孔。1～5 d用 HGF 50 ng/mL，后改為 10 ng/mL維持，3 d換液 1 次，連續(xù)培養(yǎng)，于 0、7、10、14、21 d 分別收集分化培養(yǎng)細(xì)胞，裂解液提取總RNA，測(cè)定RNA濃度，用RT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA的第1鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物由BIONEER公司合成。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4 min，然后按 94℃變性30 s→55℃退火 30 s→72℃延伸30 s，循環(huán)35次后，72℃延伸10 min。應(yīng)用千屏多媒體凝膠成像系統(tǒng)對(duì)DNA電泳條帶進(jìn)行分析，測(cè)定各條帶的面積和灰度值，得出積分灰度值，計(jì)算各個(gè)樣品與β-actin的比值作為ALB mRNA表達(dá)的相對(duì)定量，重復(fù)4次。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組均數(shù)間比較行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.7 結(jié)果

2.7.1 MTT檢測(cè)牛黃參含藥血清對(duì)WB-F344細(xì)胞增殖的影響 結(jié)果表明，10%、20%濃度的牛黃參含藥血清成分組和水煎組均能刺激WB-F344細(xì)胞的增殖，與空白、正常對(duì)照組比較OD值顯著升高（P<0.01），且10%為細(xì)胞增殖的最佳濃度梯度；各組含藥血清對(duì)WB-F344細(xì)胞作用24 h后，未表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞的毒性作用，鏡下觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)良好。見(jiàn)表1。

2.7.2 Western blot檢測(cè)牛黃參含藥血清對(duì)WB-F344細(xì)胞因子及受體表達(dá)的影響 結(jié)果表明，牛黃參含藥血清成分組和水煎組均可以刺激WB-F344細(xì)胞因子，HGFR、EGF、EGFR、TGF-β1R、TGF-β2R 的表達(dá)量升高，與正常組、空白組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01）。見(jiàn)表2。

2.7.3 RT-PCR檢測(cè)牛黃參含藥血清對(duì)WB-F344細(xì)胞ALB mRNA表達(dá)的影響 表3結(jié)果表明，牛黃參含藥血清成分組和水煎組干預(yù)的WB-F344肝干細(xì)胞表面標(biāo)志物ALB mRNA的表達(dá)在分化過(guò)程中隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增多；增漲幅度與正常組、空白組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），且成分組優(yōu)于水煎組。見(jiàn)表3。

表1 不同濃度牛黃參含藥血清對(duì)WB-F344增殖的影響（±s，n=6）

表1 不同濃度牛黃參含藥血清對(duì)WB-F344增殖的影響（±s，n=6）

注：與正常組比較，P<0.01；與空白組比較，P<0.01；與 5%比較，●P<0.01

組別OD值正常組空白組5%10%20%成分組5%10%20%水煎組5%10%20%1.068 000±0.155 004 1.113 567±0.138 459 1.170 167±0.174 112 1.120 533±0.118 125 1.083 517±0.072 461 1.432 433±0.093 332★▲●1.409 067±0.184 952★▲●1.078 950±0.073 443 1.391 367±0.065 870★▲●1.321 733±0.051 570★▲●★▲

3 討論

一直以來(lái)，許多學(xué)者致力于尋找能夠刺激肝細(xì)胞再生的基本因子，迄今關(guān)注較多的是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（SCF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、酸性成纖維細(xì)胞因子（FGF）、轉(zhuǎn)化因子 β1（TGF-β1）、轉(zhuǎn)化因子 β2（TGF-β2）、角質(zhì)細(xì)胞因子、干擾素、白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6和胰島素等等。已證實(shí)在肝臟受損后的肝細(xì)胞修復(fù)過(guò)程中，這些細(xì)胞因子通過(guò)促進(jìn)肝干細(xì)胞的增殖、分化以及拮抗其凋亡起著重要的調(diào)控作用[4]。

HGF是最早被認(rèn)識(shí)在肝再生過(guò)程中起重要作用的細(xì)胞因子之一，通過(guò)與受體HGFR相互作用而對(duì)多種細(xì)胞產(chǎn)生促有絲分裂作用及促形態(tài)形成作用，在肝臟的發(fā)育成熟和再生過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是干細(xì)胞向正常肝細(xì)胞分化有效的刺激因子之一。不過(guò)，其在細(xì)胞膜上受體數(shù)目相對(duì)固定，當(dāng)HGF達(dá)到受體飽和的濃度后，單純HGF刺激將呈現(xiàn)出一定的飽和效應(yīng)。在發(fā)育的肝臟中，HGF誘導(dǎo)ALB陰性的干細(xì)胞分化為ALB陽(yáng)性的干細(xì)胞，然后再在其他因素的作用下分化為成熟的肝細(xì)胞[5]。EGF是作用于肝干細(xì)胞增殖與分化的另一重要的細(xì)胞因子，通過(guò)與靶細(xì)胞膜上的受體EGFR結(jié)合刺激肝干細(xì)胞的增殖。EGF/EGFR在肝再生早期階段有促進(jìn)有絲分裂的作用，并且鼠類(lèi)比人類(lèi)顯得尤為重要，是鼠類(lèi)肝再生的必要條件。 TGFβ 家族（包括 TGF-β1，TGF-β2及 TGF-β3）可以抑制小鼠卵圓細(xì)胞系的有絲分裂，調(diào)節(jié)肝干細(xì)胞的增殖、分化，使其向成熟肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞分化，而不向肝細(xì)胞癌或膽管細(xì)胞癌方向發(fā)展，其中TGF-β1在體細(xì)胞中所占比例最高、活性最強(qiáng)、分布最廣[6-9]。

肝臟是合成ALB的唯一場(chǎng)所，幾乎所有的肝細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化試驗(yàn)都以ALB作為首選的檢測(cè)指標(biāo)。因?yàn)锳LB是檢測(cè)肝細(xì)胞代謝活性的一個(gè)標(biāo)志物，也是反應(yīng)肝干細(xì)胞和成熟肝細(xì)胞活性和功能良好的指標(biāo)之一[10-11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)中藥復(fù)方牛黃參含藥血清干預(yù)后，WB-F344細(xì)胞增殖明顯，10%為藥物血清增殖的最佳濃度梯度；HGFR、EGF、EGFR、TGF-β1R、TGF-β2R 表達(dá)量升高；ALB 表達(dá)顯著增多；而未經(jīng)藥物誘導(dǎo)的WB-F344對(duì)照組變化不顯著。提示牛黃、西洋參復(fù)方制劑能誘導(dǎo)肝干細(xì)胞系WB-F344向成熟肝細(xì)胞方向分化發(fā)育，且成分組牛黃參膠囊優(yōu)于水煎劑，這為應(yīng)用合適的中藥復(fù)方劑型治療重型肝炎、肝衰竭開(kāi)辟了一條新途徑，也為中西醫(yī)結(jié)合治療肝病提供了一條新思路。這些只是研究的初步結(jié)果，在中藥復(fù)方牛黃參誘導(dǎo)WB-F344細(xì)胞分化過(guò)程中是否還存在其他因素參與調(diào)節(jié)以及調(diào)節(jié)過(guò)程中具體的信號(hào)通路如何，均有待于進(jìn)一步研究。

表2 牛黃參含藥血清對(duì)WB-F344細(xì)胞因子及受體表達(dá)的影響（±s，n=4）

表2 牛黃參含藥血清對(duì)WB-F344細(xì)胞因子及受體表達(dá)的影響（±s，n=4）

注：與正常組比較，★P<0.01；與空白組比較，▲P<0.01

指標(biāo)組別正常組 空白組 成分組 水煎組HGFR TGF-β1R TGF-β2R EGFR EGF 1.039 75±0.002 44 1.417 99±0.001 81 0.975 69±0.001 97 1.227 48±0.000 82 1.361 38±0.000 61 1.046 88±0.003 12 1.368 05±0.002 39 0.990 62±0.002 01 1.249 33±0.000 58 1.348 89±0.002 05 1.323 66±0.003 55★▲1.733 37±0.001 11★▲1.241 94±0.000 55★▲1.548 33±0.002 85★▲1.770 18±0.020 83★▲1.360 02±0.001 36★▲1.748 47±0.006 98★▲1.197 18±0.000 32★▲1.530 61±0.001 47★▲1.633 80±0.020 15★▲

表3 牛黃參含藥血清對(duì)WB-F344細(xì)胞ALB mRNA表達(dá)的影響±s，n=4）

表3 牛黃參含藥血清對(duì)WB-F344細(xì)胞ALB mRNA表達(dá)的影響±s，n=4）

注：與正常組比較，★P<0.01；與空白組比較，▲P<0.01

時(shí)間（d） 正常組 空白組水煎組071 0 14 21 0.979 28±0.005 77 1.001 35±0.001 96 1.015 06±0.000 39 1.032 19±0.002 07 1.055 37±0.004 52 0.979 35±0.006 92 1.002 70±0.004 50 1.014 89±0.000 34 1.031 20±0.000 22 1.054 97±0.002 27 0.977 80 1.025 08±0.017 84 1.051 86±0.002 72 1.132 82±0.002 29★1.179 03±0.003 01★0.976 16±0.005 97 1.004 71±0.003 30 1.035 07±0.005 11 1.118 96±0.001 48★1.142 45±0.002 61★

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