舒 忻 馬大勇 林 彬 韓振蘊(yùn)

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院腦病科，北京 100078；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院腦病科，北京 100700

參知健腦膠囊主要用于血管性癡呆“正氣虧虛兼濁毒絡(luò)阻”證。癥見智力減退、思維遲鈍、神情呆滯、健忘，或喜怒不定、心煩汗出、躁擾不安、少寐多夢等。為考察小鼠單次灌胃給予供試品后的急性毒性反應(yīng)，為該藥的臨床前反復(fù)給藥的毒性研究和臨床研究提供參考信息而進(jìn)行本試驗(yàn)?，F(xiàn)將試驗(yàn)總結(jié)如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

參知健腦膠囊（批號：20100907，有效期至2012年3月7日），由人參莖葉總皂苷、知母提取物和赤芍提取物等按一定比例配伍而成，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供；滅菌注射用水（批號：20100701，有效期至2012年7月2日），由北京立時達(dá)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

4～5周齡SPF級昆明小鼠，雌雄各20只，體重雌性18.5～20.5 g，雄性：18.6～21.5 g，所有動物體重均不超過或低于同性別動物平均體重的20%。實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（京）2009-0024。

1.3 動物飼養(yǎng)與管理

所有動物購入后，經(jīng)獸醫(yī)接收進(jìn)行檢疫；SPF級環(huán)境動物房；標(biāo)準(zhǔn)SPF級鼠飼料（供應(yīng)單位：北京科澳協(xié)力飼料有限公司；動物飼料生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2009-0012）；動物飲用純化水，用飲水瓶供應(yīng)；刨花材質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室專用墊料；動物飼養(yǎng)于裝有墊料的聚丙烯鼠盒中，鼠盒規(guī)格為長×寬×高＝295 mm×195 mm×125 mm，雌雄分養(yǎng)，每盒最多飼養(yǎng)同性別5只動物。動物自由攝食，自由攝水；設(shè)定的動物房溫度范圍是20～25℃，實(shí)測溫度范圍是20.0～23.2℃。設(shè)定的動物房濕度范圍是40%～70%，實(shí)測濕度范圍是40%～60%。光照12 h明暗交替；墊料每周更換2次，同時更換鼠盒。每天更換高壓消毒過的飲水瓶和瓶塞。所有換洗的籠具清洗過后均采用高壓滅菌；籠架每周消毒1次，動物房地面每天消毒1次，動物房墻面每周消毒1次，用0.1%新潔爾滅或0.5%的84消毒液擦拭消毒，兩種消毒液交叉使用，每周交叉1次。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 給藥前從44只動物中挑選檢疫合格、體重相近的雌雄各20只動物，用區(qū)段隨機(jī)分組法，按性別將動物分為兩個區(qū)段，用Excel軟件給予每只動物一個隨機(jī)數(shù)，并按照隨機(jī)數(shù)從小到大的排序，將小鼠分為兩組，即陰性對照組和供試品組每組，雌雄各10只，其中陰性對照組動物給予滅菌注射用水。見表1。

1.4.2 供試品配制及給藥 稱取適量的供試品，用滅菌注射用水溶解，配成終濃度為200 mg/mL的供試品溶液。溶解后的供試品常溫保存；給藥途徑為灌胃，給藥頻率為單次給藥，給藥容量為25 mL/kg，給藥方法為動物灌胃前禁食過夜，藥后再禁食1 h。用一次性使用1 mL無菌注射器準(zhǔn)確抽取所需溶液，用12號灌胃針經(jīng)口灌胃給藥；給藥方式選擇的理由是臨床擬用途徑為口服，本試驗(yàn)采用經(jīng)口灌胃給藥，與臨床擬用途徑基本相同。

表1 動物的組別、劑量和動物號

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 臨床觀察 給藥后籠旁觀察，1 h內(nèi)連續(xù)觀察，每15 min記錄1次，1～4 h內(nèi)每1 h觀察1次；4 h后結(jié)束觀察；其他觀察時間：檢疫馴養(yǎng)期和給藥后次日開始，每天上午和下午各進(jìn)行1次一般臨床觀察，第7天和第14天進(jìn)行詳細(xì)臨床觀察，觀察期為14 d。在同一時間段，一般臨床觀察與詳細(xì)臨床觀察不重復(fù)實(shí)施。一般臨床觀察內(nèi)容主要包括籠旁觀察動物死亡或?yàn)l死情況、精神狀態(tài)、行為活動、進(jìn)食情況、糞便性狀等；詳細(xì)臨床觀察內(nèi)容：精神狀態(tài)、行為活動、皮膚、被毛、眼、耳、鼻、腹部、外生殖器、肛門、四肢、足和呼吸等。

1.5.2 體重 給藥前、第8天、第15天測定動物體重。

1.5.3 食量 每周加料1次，第8天、第15天稱取每籠剩余飼料量，據(jù)加料量和剩余飼料量算出平均每天每只動物食量，以 g/只/天表示。

1.5.4 病理檢查 所有動物均進(jìn)行大體解剖，大體解剖所見異常的組織器官進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.6 動物安樂死方法

觀察期結(jié)束（第15天）所有存活動物，使用CO2吸入麻醉法將動物麻醉，之后股動脈放血安樂死。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件，，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，分析動物體重和食量的變化趨勢，根據(jù)病理檢查和臨床觀察結(jié)果，綜合判斷供試品的急性毒性反應(yīng)情況。動物體重進(jìn)行獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察

給藥后，連續(xù)觀察4 h，動物呼吸平穩(wěn)、活動正常，未見異常反應(yīng)。14 d的觀察期間，未見動物發(fā)生死亡或?yàn)l死，各組動物精神狀態(tài)、行為活動等均未見明顯異常。

2.2 體重

試驗(yàn)期間，各組動物的體重增長趨勢相似，供試品給藥組動物體重與同期同性別陰性對照組動物比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見表2。

表2 參知健腦膠囊單次灌胃給予小鼠體重變化情況（±s，g）

表2 參知健腦膠囊單次灌胃給予小鼠體重變化情況（±s，g）

性別 組別 劑量（mg/只） 只數(shù) 給藥前 第8天 第15天雌性0雄性陰性對照組供試品組陰性對照組供試品組5 000 0 5 000 10 10 10 10 19.6±0.6 19.4±0.8 19.7±0.8 19.3±0.6 28.1±1.1 28.3±1.8 34.3±2.7 32.0±2.2 31.6±2.2 32.0±1.8 41.8±3.2 39.1±3.0

2.3 食量

供試品組與同期同性別陰性對照組動物的攝食量相似，未見藥物對動物食量有明顯影響。見表3。

表3 參知健腦膠囊單次灌胃給予小鼠食量變化情況（±s，g/只/天）

表3 參知健腦膠囊單次灌胃給予小鼠食量變化情況（±s，g/只/天）

性別 組別 劑量（mg/只） 只數(shù) 第1周 第2周雌性0雄性陰性對照組供試品組陰性對照組供試品組5 000 0 5 000 2222 4.80±0.14 4.85±0.07 6.50±0.14 6.00±0.00 4.85±0.35 5.05±0.21 7.25±0.07 6.90±0.28

2.4 病理檢查

所有動物均按計劃安樂死，進(jìn)行大體解剖觀察，各組織臟器均無肉眼可見異常改變。

2.5 影響研究可靠性和造成研究工作偏離實(shí)驗(yàn)方案的異常情況

試驗(yàn)中未見可能影響研究可靠性和造成研究工作偏離試驗(yàn)方案的異常情況。

3 討論

參知健腦膠囊是以王永炎院士提出的血管性癡呆“正虛毒損絡(luò)阻”創(chuàng)新病因病機(jī)學(xué)說為指導(dǎo)研發(fā)而得[1-4]，主要由人參、知母、赤芍等藥物提取物按一定比例優(yōu)化配伍而成[5]，具有扶正、通絡(luò)、解毒的功效[6-7]，是國家重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目的候選新藥。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷具有提高擬癡呆模型動物的學(xué)習(xí)記憶能力、改善腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的含量及作用、減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡、保護(hù)海馬神經(jīng)元和突觸、增加血管新生、保護(hù)腦損傷等作用[8-12]，知母提取物能夠改善癡呆動物的學(xué)習(xí)記憶能力、良性調(diào)節(jié)癡呆動物的膽堿能系統(tǒng)及清除自由基等[13-17]。芍藥提取物可以提高癡呆動物的學(xué)習(xí)記憶能力，對神經(jīng)細(xì)胞缺氧、缺糖、氧自由基及一氧化氮神經(jīng)毒性等損傷有顯著保護(hù)作用[18-20]。

前期動物研究中發(fā)現(xiàn)，參知健腦膠囊可明顯改善大鼠的學(xué)習(xí)、記憶功能，減輕其海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷，增加癡呆大鼠海馬組織中Ach的水平[21]，并可通過降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，拮抗Aβ引起的細(xì)胞毒性，抑制細(xì)胞凋亡，而具有治療神經(jīng)退行性疾病的功效[6]。

在本試驗(yàn)條件下，參知健腦膠囊單次灌胃給予昆明小鼠，在5 000 mg/kg的劑量下，未見小鼠出現(xiàn)毒性反應(yīng)。按體重計算，此劑量相當(dāng)于臨床擬用劑量的286倍。說明參知健腦膠囊安全劑量范圍較廣，安全性較好。

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