李姣姣，李超，王乃馨，鄭義，王衛(wèi)東

（徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008）

了哥王[Wikstroemiaindica（L.）C.A.Mey.]始載于《嶺南采藥錄》，為瑞香料蕘花屬植物,苦寒、微辛、有毒，清熱解毒、化痰散結(jié)、通經(jīng)利水，可用于治療扁桃體炎、腮腺炎、淋巴結(jié)炎、支氣管炎、哮喘、肺炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷、麻風(fēng)、閉經(jīng)、水腫等疾病，其主要含有黃酮類化合物等有效成分[1-6]。大孔吸附樹脂是一類不溶于酸、堿及各種有機(jī)溶劑且有較好吸附性能的有機(jī)高聚物吸附劑，近年來廣泛被應(yīng)用于醫(yī)藥、環(huán)保和食品等領(lǐng)域[7]，在中草藥研究方面也較廣泛，尤其在黃酮類化合物中：如紅樹莓總黃酮[8]，銀杏葉總黃酮[9]和杭白菊總黃酮[10]等及其他各類成分均有采用大孔吸附樹脂法進(jìn)行分離純化的研究。而應(yīng)用于了哥王總黃酮分離純化方面鮮見報道，故本研究對AB-8型大孔吸附樹脂純化了哥王總黃酮的工藝進(jìn)行研究，為該資源的進(jìn)一步開發(fā)提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

了哥王購自安徽亳州藥材市場，經(jīng)江南大學(xué)食品學(xué)院高獻(xiàn)禮博士鑒定；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：南京替斯艾么中藥研究所，批號：TCM027-090316；AB-8型大孔吸附樹脂：安徽三星樹脂有限公司；其他均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀：上海新拓分析儀器科技有限公司；SBS數(shù)控記滴自動部分收集器：上海滬西分析儀器廠；pHS-3C型酸度計：上海雷磁儀器廠；7230G可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；LGJ-10冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品溶液的制備方法

精確稱取1.4 g原料于100 mL特制三角瓶中，然后加入70%乙醇42 mL、在微波功率400 W的條件下提取時間120 s后，抽濾、定容于100 mL、測定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

以蘆丁為對照品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法[11]。精確稱取蘆丁20 mg置于250 mL容量瓶中，加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，配成0.08 mg/mL的對照品儲備液。精確量取對照品儲備液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10 mL具塞刻度試管中，先依次分別加60%乙醇 5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0 mL，再加入 0.3 mL 5%NaNO2搖勻后靜置6 min，再加入0.3 mL 10%Al（NO3）3搖勻后靜置6 min，最后加入4 mL 1 mol/L NaOH后用60%乙醇定容至刻度，搖勻后靜置10 min，以60%乙醇為空白參比，于波長510 nm處測定吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得回歸方程：A=11.688C－0.0301，R2＝0.9990，結(jié)果表明在 0.008 mg/mL～0.040 mg/mL之間線性良好。

1.3.3 大孔吸附樹脂的預(yù)處理[12]

按文獻(xiàn)[12]方法稍加修改：將準(zhǔn)備裝柱的新樹脂先用適量的乙醇浸泡充分溶脹，然后裝柱，以4 BV/h～5 BV/h的流速使5倍～8倍的乙醇通過樹脂層，洗至流出液加適量的水無白色渾濁現(xiàn)象，再以8 BV/h～10 BV/h的流速使雙蒸水通過樹脂層，洗盡醇，最后轉(zhuǎn)入酸堿處理，即用200 mL的5%HCl溶液，以5 BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡3 h，而后用雙蒸水以同樣流速洗至出水pH為中性，再用200 mL的5%NaOH溶液，以5 BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡3 h，而后用雙蒸水以同樣流速洗至出水pH中性。

1.3.4 靜態(tài)吸附試驗(yàn)

取大孔吸附樹脂6.0800 g（用濾紙吸干后稱重，干重1.3848 g），裝入250 mL具塞磨口三角瓶中，精密加入30 mL濃度為0.493 mg/mL的樣液，避光密封，并置恒溫振蕩器中，在30℃下，以120 r/min振蕩24 h（其中在前8小時內(nèi)，每小時各取1mL；在第24小時取1mL，共9個1 mL），測定這9個1 mL的總黃酮濃度，繪制靜態(tài)吸附曲線。

1.3.5 動態(tài)吸附洗脫試驗(yàn)

首先將預(yù)處理好的樹脂濕法裝入（1.6 cm×20 cm，1 BV為30 mL）玻璃層析柱中，然后將了哥王總黃酮提取液上柱，待樣品溶液全部通過樹脂柱后用去離子水洗至流出液無色，最后洗脫，收集洗脫液。通過測定總黃酮含量考察各因素對樹脂性能的影響，確定最佳工藝條件。

1.3.6 吸附容量和吸附率的測定

式中：R 為吸附容量，（mg/g）；C0為吸附液初始濃度，（mg/mL）；C1為吸附液平衡濃度，（mg/mL）；V1為吸附液體積，mL；W為樹脂干重，g。

假設(shè)吸附前后吸附液體積不變，可由下列公式計算吸附率。

式中：S為吸附率；C0為吸附液初始濃度，（mg/mL）；C1為吸附液平衡濃度，（mg/mL）。

1.3.7 洗脫率的測定

式中：T為洗脫率；C0為吸附液初始濃度，（mg/mL）；C1為吸附液平衡濃度，（mg/mL）；V1為吸附液體積，mL；C2為洗脫液濃度，（mg/mL）；V2為洗脫液體積，mL。

1.3.8 純度的測定

分別將提取液和洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收乙醇后冷凍干燥，得到粉狀產(chǎn)品，再分別準(zhǔn)確稱取總黃酮提取物和純化物粉末0.02 g，70%乙醇定容，搖勻，測定，計算總黃酮純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)吸附洗脫試驗(yàn)

2.1.1 吸附容量、吸附率及洗脫率

吸附容量、吸附率及洗脫率見表1。

表1 吸附容量、吸附率及洗脫率Table 1 Adsorption capacity,adsorption rate and elution rate

由表1可以看出，AB-8型大孔吸附樹脂不僅有較大的吸附率，還有較高的洗脫率。

2.1.2 靜態(tài)吸附曲線

僅僅以大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附率來評價其吸附性是不全面的，合適的吸附樹脂除了具有較大的吸附容量、吸附率和洗脫率外，同時還要有較快的吸附效果，故將AB-8大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附動力學(xué)試驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可知，AB-8型大孔吸附樹脂對了哥王總黃酮的吸附為快速平衡型，起始階段的總黃酮濃度較大，在1 h后基本達(dá)到平衡，AB-8型大孔吸附樹脂對了哥王總黃酮具有良好的吸附動力學(xué)特性。綜上分析可知，該樹脂對了哥王總黃酮具有良好的吸附洗脫特性，適合了哥王總黃酮的分離純化。

圖1 靜態(tài)吸附曲線Fig.1 Static absorption curve

2.2 動態(tài)吸附洗脫試驗(yàn)

2.2.1 上樣液濃度對吸附效果的影響

在上樣液流速2 BV/h和上樣液pH 5.4的條件下，考察不同上樣液濃度對樹脂吸附效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 上樣液濃度的影響Fig.2 Effects of concentrations of sample solution

由圖2可知，低濃度不利于總黃酮的吸附，因?yàn)樯蠘右簼舛绕停讲怀浞?；高濃度? mg/mL）時，了哥王水溶液易發(fā)生沉淀現(xiàn)象；當(dāng)以1.5 mg/mL上柱時，吸附率較大，所以在此選擇上樣液濃度為1.5 mg/mL。

2.2.2 上樣液流速對吸附效果的影響

在上樣液濃度1.5 mg/mL和上樣液pH 5.4的條件下，通過調(diào)節(jié)恒流泵的轉(zhuǎn)速對上樣液進(jìn)行吸附流速的選擇，考察不同上樣液流速對樹脂吸附效果的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，隨著上樣液流速的增加，吸附量先稍微增加而后降低。上樣液流速低，較利于總黃酮的吸附，但循環(huán)周期長；當(dāng)以2 BV/h上柱時，吸附量最大；上樣液流速大于2 BV/h時，由于流速過快，樹脂還未來得及吸附，樣液就已流出。所以在此選擇上樣液流速為2 BV/h。

圖3 上樣液流速的影響Fig.3 Effects of velocity of sample solution

2.2.3 上樣液pH對吸附效果的影響

上樣液pH對吸附、分離效果的影響是十分重要的。根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)調(diào)整上樣液pH，可達(dá)到較好的吸附效果。在上樣液濃度1.5 mg/mL和上樣液流速2 BV/h的條件下，考察不同上樣液pH對樹脂吸附效果的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 上樣液pH的影響Fig.4 Effects of pH values of sample solution

由圖4可知，從吸附量上考慮，pH 5.4的條件進(jìn)行吸附比較合適。這是因?yàn)辄S酮類化合物含多羥基，呈弱酸性。故要達(dá)到較好的吸附效果，吸附需在pH 5.4條件下進(jìn)行。

2.2.4 動態(tài)吸附曲線

在上樣液濃度為1.5 mg/mL、上樣液流速2 BV/h和上樣液pH 5.4的條件下通過已處理好的樹脂柱，進(jìn)行動態(tài)吸附，結(jié)果見圖5。

圖5 動態(tài)吸附曲線Fig.5 Dynamic absorption curve

從圖5可知，上樣液體積達(dá)到32 mL時樹脂基本不再吸附總黃酮（此時吸附量為30.234 mg/g，吸附率為89.62%）。動態(tài)吸附曲線進(jìn)一步說明AB-8型大孔吸附樹脂對總黃酮有較大的吸附量，適用于純化了哥王總黃酮。

2.2.5 洗脫液濃度對洗脫效果的影響

洗脫流速過快，洗脫性能差，洗脫帶寬，而且脫尾嚴(yán)重，洗脫不完全；但是流速過慢，則會延長生產(chǎn)周期，通常情況下控制洗脫流速為吸附流速的1/3～1/2[13]。本實(shí)驗(yàn)固定洗脫流速為吸附流速的1/2來考察不同洗脫液濃度對洗脫效果的影響（其他條件為上樣液濃度為1.5 mg/mL、上樣液流速 2 BV/h、上樣液 pH5.4），結(jié)果見圖6。

圖6 洗脫液濃度的影響Fig.6 Effects of concentrations of desorption solution

由圖6可知，70%乙醇的洗脫率和90%乙醇的洗脫率差不多，考慮到成本問題，所以選擇洗脫液濃度為70%。

2.2.6 動態(tài)洗脫曲線

在上樣液濃度為1.5mg/mL、上樣液流速2BV/h、上樣液pH5.4、洗脫液濃度為70%和洗脫液流速1 BV/h的條件下，進(jìn)行動態(tài)洗脫，結(jié)果見圖7。

圖7 動態(tài)洗脫曲線Fig.7 Dynamic elution curve

由圖7可知，70%乙醇通過約30 mL時總黃酮開始被洗脫下來，之后在40 mL附近時迅速達(dá)到高峰，通過80 mL后，吸附在樹脂上的總黃酮基本被洗脫下來，洗脫曲線出峰快，僅稍有拖尾現(xiàn)象。

2.3 純度測定結(jié)果

純度測定結(jié)果見表2。

表2 總黃酮的純度Table 2 Purity of total flavonoids %

由表2可知，經(jīng)純化后，純度由原來的8.05%提高到了20.60%，提高了1.56倍。

3 結(jié)論

1）AB-8型大孔吸附樹脂為理想的了哥王總黃酮分離純化的樹脂，它的吸附率為74.84%，洗脫率為79.68%。

2）AB-8型大孔吸附樹脂分離純化了哥王總黃酮的吸附的最佳工藝參數(shù)為上樣液濃度1.5 mg/mL、上樣液流速2 BV/h和上樣液pH 5.4，洗脫的最佳工藝參數(shù)為洗脫液濃度70%乙醇、洗脫液流速1 BV/h和洗脫劑用量為80 mL；在最佳工藝參數(shù)條件下了哥王純化產(chǎn)品中總黃酮的純度由8.05%提高到20.60%，提高了1.56倍，由此可以看出AB-8型大孔吸附樹脂可以有效地分離純化了哥王總黃酮。

[1]謝宗萬.全國中草藥匯編(上冊)[M].2版.北京:人民出版社,1996:10-12

[2]國家中醫(yī)藥管理局.中華本草(第五冊)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1999:423-425

[3]朱雅敏,胡敏燦.了哥王的藥理研究和臨床應(yīng)用[J].浙江中醫(yī)雜志,2004(2):42-43

[4]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典(上冊)[M].上海:上海科技出版社,1992:51-53

[5]陳爽,邵曼莉,楊振宇,等.正交試驗(yàn)優(yōu)選了哥王的提取工藝[J].中草藥,2007,38(2):208-210

[6]李艷敏,姜建國,余進(jìn)峰.了哥王總黃酮提取工藝的優(yōu)化研究[J].現(xiàn)代食品科技,2009,25(6):653-655,624

[7]朱英,何遠(yuǎn),李麗.大孔樹脂對地錦草、金銀花葉與杭白菊總黃酮吸附分離性能研究[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2007,36(1):56-59

[8]楊國偉,白立敏,蘇東海,等.大孔吸附樹脂純化紅樹莓總黃酮的研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報,2008,17(2):147-150,154

[9]李月,陳瑩.大孔吸附樹脂分離純化銀杏葉總黃酮的研究[J].化學(xué)與生物工程,2009,26(7):55-57

[10]閆克玉,于靜.大孔吸附樹脂法純化杭白菊總黃酮[J].現(xiàn)代食品科技,2008,24(1):35-38

[11]陳健,姚成.野馬追中總黃酮的測定[J].南京師范大學(xué)學(xué)報,2004,4(2):16-18

[12]蔡正云,李莉,何建國.槲寄生中黃酮類化合物純化工藝研究[J].食品研究與開發(fā),2009,30(3):40-44

[13]張晴,陳勇.AB-8大孔吸附樹脂對紫蘇色素的吸附性能的研究—pH=3.0時吸附等溫線和吸附流出曲線的測定[J].食品與發(fā)酵工業(yè),1999,25(3):18-21