丁治國 何 蓓 陳曉珩 汪唐順 高 翔 李乃卿
1.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院,北京 100700;2.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院,北京 100029
血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是特異性血管內皮細胞有絲分裂素,與受體結合后促進內皮細胞分裂、增殖、遷移,加速形成新生血管。研究表明,VEGF及其受體在肝癌癌組織中較正常肝組織呈過表達,并與肝癌的生長、轉移、復發(fā)及治療密切相關[1-3]。因此,VEGF已成為目前腫瘤抗血管治療的熱點。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)課題組原研藥物參芪扶正注射液可顯著抑制人肝癌細胞MHCC97L的生長、侵襲能力,并能下調VEGF基因表達。為進一步明確VEGF基因“沉默”時藥物作用的變化,本研究構建了能轉錄產(chǎn)生VEGF shRNA的質粒,進而構建并包裝產(chǎn)生高滴度的慢病毒RNAi載體,并實現(xiàn)其在人肝癌細胞MHCC97L中表達,抑制MHCC97L細胞中VEGF基因的表達,為進一步深入研究VEGF基因與參芪扶正注射液藥物效果的關系奠定基礎。
Platimum HIFI Taq Polymerase高保真擴增酶、Trizol Reagent、5×First-Strand buffer、0.1 mol/L dTT、SYBR Green I、Rnase out、oligo dT/Random primer/特異性引物、10×PCR Buffer、Mg2+(50 mmol/L)、Platinum Taq DNA Polymerase、100 mmol/L
dNTPs(購自美國Invitrogen公司);T載體、plenti6.3MIR載體、293細胞、DH5α感受態(tài)細胞、ddwater(購自上海諾百生物科技有限公司);T4 Ligase(購自加拿大NEB公司);DMEM培養(yǎng)基(購自美國HYCLONE公司);FBS(購自法國biowest公司);24孔和6孔細胞培養(yǎng)板(購自美國Corning公司);熒光顯微鏡(購自日本Olympus公司),熒光定量PCR儀(購自美國Bio Rad公司)。
1.2.1 載體的構建和鑒定 針對人類VEGF基因mRNA序列(NCBI GenBank,基因編號:AF022375),利用 invitrogen 公司BLOCK IT RNAi DESIGNER工具設計干擾序列如下,200-F:TGCTGTGAAGATGTACTCGATCTCATGTTTTGGCCACTGACTGACATGAGATCGTACATCTTCA;200-R:TGCTGTGAAGATG TACTCGATCTCATGTTTTGGCCACTGACTGACATGAGATCGTACATCTTCA; Negative-F:TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT;Negative-R:CCTGAAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTTC。將 2對 oligo(包括陰性對照鏈)退火成雙鏈。然后連接線性化的plenti6.3-MIR載體,構建2個miRNA慢病毒載體質粒,并轉化至感受態(tài)細胞DH5α。挑選陽性克隆,用載體通用引物進行菌落PCR篩選。篩選得到的陽性克隆進行測序,以驗證重組克隆中插入片段序列是否與設計的oligo序列一致。
1.2.2 RNAi慢病毒的包裝 取對數(shù)生長期細胞293T細胞,按照每個10 cm的培養(yǎng)皿6×106個細胞數(shù)接種于培養(yǎng)皿中。轉染前2 h將細胞培養(yǎng)基更換為Opti-MEM培養(yǎng)液;取9 μg Packaging Mix和 3 μg慢病毒表達質粒加入 1.5 mL Opti-MEM(經(jīng) 37℃預熱)中混勻;取 36 μL lipofectamine2000 加入1.5 mL Opti-MEM中混勻;混合質粒溶液和lipofectamine 2000稀釋液,置室溫20 min;將3 mL質粒脂質體復合物加入到細胞培養(yǎng)皿中混勻,置37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育6 h后,更換完全培養(yǎng)液DMEM+10%FBS;48 h后收集細胞培養(yǎng)上清,3 000 r/min離心10 min,去除細胞和碎片,并用0.45 μm的濾器過濾;將病毒原液在50 000 g下超速離心2 h,去除上清,重懸于200 μL DMEM培養(yǎng)液中,分裝小管,放置于-80℃下備用。
1.2.3 孔稀釋法測定病毒滴度 測定前1 d,對293T細胞進行傳代,96孔板上每孔加入約8 000個細胞,體積100 μL。將病毒儲存液按梯度稀釋(每50微升中含慢病毒液1×10-3~1×10-8mL),吸去96孔板中原先的培養(yǎng)基,然后在每孔中加入50 μL慢病毒稀釋用培養(yǎng)基,混勻各管慢病毒稀釋液,再各取50 μL慢病毒稀釋液加入到每孔細胞中,每個稀釋度3個重復。繼續(xù)放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后,每孔加入100 μL新鮮培養(yǎng)液。5~6 d后觀察熒光表達,正常情況下,熒光細胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)增加而相應減少,計數(shù)最大稀釋倍數(shù)孔中的帶有熒光的細胞個數(shù),病毒滴度(TU/mL)=(熒光細胞個數(shù)×轉染時細胞數(shù)/100×每孔加入病毒稀釋液體積)×1/稀釋濃度。
1.2.4 熒光定量PCR檢測VEGF表達 以MOI值100浸染人肝癌MHCC97L細胞48 h后收集細胞。按Trizol裂解液說明書進行細胞RNA的抽提;按照逆轉錄試劑盒說明進行逆轉錄:取 1 μg RNA,用 oligodt18 引物,42℃ 60 min,70℃ 5 min進行逆轉錄。VEGF上游引物 5’-ACTGCCATCCAATCGA GACCC-3’,下游引物 5’-TGAGGTTTGATCCGCATAATC-3’。內對照β-Actin上游引物5’-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3’,下游引物5’-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3’。按實時PCR試劑盒說明配制反應體系,反應置于熒光定量PCR儀中,設定程序:預變性 95℃ 120 s;95℃ 10 s,60℃ 30 s,70℃ 45 s,40個循環(huán);熒光信號實時檢測。以MHCC97-空白組細胞為對照,采用 2-△△CT(CT 代表循環(huán)閾值)法計算相對定量。
測序結果證實oligo已正確連接入plenti6.3-MIR,序列與預期序列完全一致(圖1)。
圖1 oligo連接plenti6.3-MIR測序(部分)
plenti6.3-MIG-200轉染實驗24 h后,在熒光顯微鏡下(×100)同一視野的熒光和可見光照片對比,可見大部分細胞發(fā)出熒光(圖2),說明轉染成功。
圖2 在熒光顯微鏡下觀察RNAi慢病毒的包裝(×100)
根據(jù)熒光顯微鏡和普通顯微鏡(×100)下同時觀察plenti6.3-MIG-200病毒感染293T細胞,在熒光顯微鏡下,在加入10-8mL病毒原液的孔中觀察到表達綠色熒光的細胞分別為37、25和 35 個, 則病毒的滴度為:[(37+25+35)TU/3]/1×10-8mL=3.23×109TU/mL。
RNAi慢病毒對人肝癌MHCC97L細胞的浸染率大于90%(圖3),熒光定量PCR數(shù)據(jù)結果顯示:MHCC97-200組RNAi慢病毒對VEGF基因的干擾效率達到72.2%(表1)。
圖3 在熒光顯微鏡下觀察plenti6.3-mir-200浸染48 h后效果
表1 熒光定量PCR檢測RNAi慢病毒對VEGF基因的干擾效率
RNAi是一種轉錄后基因沉默現(xiàn)象,具有序列特異性的特點,shRNA可被切割為小干擾性RNA(small interfering RNAs,siRNA),大小一般為21~23個核苷酸,以siRNA作為引導序列,與其具有完全互補序列的同源mRNA,具有特異性抑制目的基因表達的功能,并且新產(chǎn)生的siRNA可形成沉默復合物,繼續(xù)對mRNA降解,從而產(chǎn)生級聯(lián)放大效應[4-5]。由于RNAi技術抑制目的基因表達的效果確切,并且具有穿透性高和級聯(lián)式放大效應等特點,因而在基因功能研究中具有很好的應用前景[6]。
慢病毒載體是一種新的病毒載體系統(tǒng),是在HIV-Ⅰ病毒的改造基礎上形成的,其能夠高效率地向動物或人的細胞系中導入目的基因,慢病毒載體具有明顯的優(yōu)點,其介導的目的基因可完全整合到宿主細胞的基因組中,發(fā)揮基因表達或沉默作用持續(xù)并且穩(wěn)定,并且不隨著細胞的傳代而減弱,從而實現(xiàn)目的基因的長期表達[7],這一點與目前常見的腺病毒載體、腺相關病毒載體和傳統(tǒng)逆轉錄病毒載體相比具有顯著優(yōu)勢。當慢病毒載體用于RNAi研究時,不但可以高效抑制目的基因的表達,同時還可以充分發(fā)揮其作為病毒載體的自身優(yōu)勢,是基因功能研究中的有力工具[8-10]。
筆者前期研究發(fā)現(xiàn)課題組的原研藥物——參芪扶正注射液,可顯著抑制人肝癌細胞MHCC97L的生長、侵襲能力,并能下調VEGF基因表達,為進一步明確VEGF基因是否是藥物發(fā)揮抑瘤作用的關鍵,需要在體內外實驗中實現(xiàn)VEGF基因在人肝癌細胞MHCC97L中“沉默”,以便在VEGF基因沉默狀態(tài)下進一步研究藥物抑瘤作用的變化。本研究成功構建了能轉錄產(chǎn)生VEGF shRNA的質粒,進而構建并包裝產(chǎn)生高滴度的慢病毒RNAi載體,并有效整合至人肝癌MHCC97L細胞中,顯著抑制了MHCC97L細胞中VEGF基因的表達,抑制率達72.2%,這將為今后從體內、體外系統(tǒng)研究VEGF沉默對參芪扶正注射液抑瘤作用變化的影響提供可靠的技術平臺。
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