張晨光 王輝 牛志國 時慧森 尹明梅 王雪平 胡亞會 鄭融融 孔海瑞 陳 儀 胡麗華(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗科，武漢430022)

HMGB1調(diào)控區(qū)Jurkat穩(wěn)定細胞株的構(gòu)建①

張晨光 王輝②牛志國②時慧森③尹明梅③王雪平③胡亞會③鄭融融③孔海瑞③陳 儀③胡麗華(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗科，武漢430022)

目的:構(gòu)建不同長度的高遷移率族蛋白1(HMGB1)基因調(diào)控序列的真核表達載體及其穩(wěn)定表達的Jurkat細胞株，為研究HMGB1基因在白血病發(fā)病機制建立基礎(chǔ)。方法:以Jurkat細胞基因組為模板，PCR擴增3'端固定的8個不同長度的HMGB1調(diào)控基因(－83 bp～+83 bp、－383 bp～+83 bp、－504 bp～+83 bp、－688 bp～+83 bp、－975 bp～+83 bp、－1 163 bp～+83 bp、－1 327 bp～+83 bp、－1 520 bp～+83 bp)，均將其連入pMD18-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。對氨芐青霉素篩選的陽性克隆進行擴增、質(zhì)粒抽提，應(yīng)用KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定和DNA測序獲得序列正確的陽性克隆，然后再經(jīng)酶切連入pGL3-neo-luc質(zhì)粒，成功構(gòu)建HMGB1基因調(diào)控序列報告基因pGL3-HMGB1-luc(按由短至長順序依次命名為1～8號質(zhì)粒)。利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將不同長度的pGL3-HMGB1-luc質(zhì)粒和pGL3-neo-luc質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至Jurkat細胞，48小時后加入終濃度600 μg/ml的G418進行藥物加壓篩選，20天后得到有效轉(zhuǎn)染pGL3-HMGB1-luc及pGL3-neo-luc載體的Jurkat細胞株(按有無HMGB1調(diào)控基因及其由短至長順序，依次命名為NEO細胞和1～8號細胞)。通過檢測熒光素酶活性，驗證構(gòu)建的Jurkat穩(wěn)定細胞株(Jurkat-HMGB1)。結(jié)果HMGB1調(diào)控基因成功插入到pGL3-neo-luc的XhoⅠ和HindⅢ位點之間構(gòu)建出3號質(zhì)粒;HMGB1調(diào)控序列1016 bp定向克隆至3號質(zhì)粒的KpnⅠ和XhoⅠ位點之間，成功構(gòu)建出8號質(zhì)粒;將166、466、771、1 058、1 246、1 410 bp長度的HMGB1調(diào)控基因定向克隆至3號質(zhì)粒的KpnⅠ和HindⅢ位點之間，分別構(gòu)建出1號、2號、4號、5號、6號、7號質(zhì)粒。8個質(zhì)粒均經(jīng)KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ雙酶切，電泳顯示條帶與擴增的HMGB1調(diào)控序列長度一致。HMGB1-T載體的DNA測序結(jié)果與NCBI提供序列完全匹配。成功構(gòu)建了不同長度的3'端固定的pGL3-HMGB1-luc報告基因。pGL3-neo-luc和pGL3-HMGB1-luc穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至Jurkat細胞后，成功構(gòu)建了NEO細胞和穩(wěn)定細胞株HJ1～8，其熒光素酶發(fā)光值分別為:123、151 288、136 057、110 623、100 874、214 523、147 597、161 348、145 490。結(jié)論:構(gòu)建的HMGB1調(diào)控序列報告基因和HJ穩(wěn)定細胞株為找尋有意義的HMGB1調(diào)控區(qū)域，以及后期研究HMGB1基因在成人T淋巴細胞白血病中的發(fā)病機制奠定了基礎(chǔ)。

HMGB1調(diào)控基因;Jurkat細胞;報告基因;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

人高遷移率族蛋白1(High mobility group box1，HMGB1)是一種廣泛存在于真核生物細胞內(nèi)的非組蛋白染色質(zhì)核蛋白，一種重要的晚期炎癥介質(zhì)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在多種腫瘤細胞中高表達，其中也包括淋巴瘤細胞、部分白血病患者骨髓細胞，同時HMGB1與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移及臨床分期均密切相關(guān)［1-3］。成人T淋巴細胞白血病(Adult T cell leukemia，ATL)是成人T淋巴細胞白血病病毒1型(Human T cell leukemia virus type 1，HTLV-1)感染后導(dǎo)致的血液腫瘤，其中病毒蛋白Tax扮演著關(guān)鍵角色，為便于以后研究HMGB1在成人T淋巴細胞白血病中的作用，以及Tax蛋白對HMGB1的調(diào)控影響，筆者構(gòu)建不同長度的HMGB1調(diào)控序列的基因真核表達載體，并轉(zhuǎn)染至人淋巴細胞瘤細胞(Jurkat)，篩選并成功構(gòu)建了其Jurkat穩(wěn)定細胞株。

1 材料與方法

1.1 材料T淋巴細胞系Jurkat E6-1細胞購于美國ATCC;報告基因pGL3-neo-luc質(zhì)粒由鄭州大學(xué)趙國強教授惠贈;pSV-β-galactosidase質(zhì)粒購自Promega公司;pMD18-T載體、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶均購自大連寶生物，RPMI1640培養(yǎng)基、G418購自Invitrogen公司;胎牛血清購自杭州四季青;胰蛋白胨和酵母提取物購自英國OXOID公司;Taq酶、pfu高保真酶、DNA Marker III、PCR及DNA回收純化試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒、基因提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，脂質(zhì)體TransFast、熒光素報告基因檢測試劑盒、β-Gal檢測試劑盒購自Promega公司。所用引物(3'端固定)均由上海生工公司合成(見表1)。大腸桿菌DH5α由本室保存。構(gòu)建的質(zhì)粒均由北京英駿生物公司進行序列測定。

表1 PCR引物序列Tab.1 Primers used in PCR

1.2 實驗方法

1.2.1 HMGB1-3調(diào)控序列(587bp)熒光素酶報告基因(pGL3-HMGB1-3-luc)的構(gòu)建參考NCBI中的HMGB1的調(diào)控序列自行設(shè)計HMGB1-8的引物，以Jurkat細胞基因組DNA為模板，擴增片段大小為1 603 bp。擴增條件為:95℃預(yù)變性10分鐘，94℃變性30秒，45℃退火3分鐘，72℃延伸3分鐘，30個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈下觀察結(jié)果。1 603 bp的擴增片段經(jīng)純化后連入pMD18-T載體，即為HMGB1-8-T載體(北京英駿生物公司測序)。而后HMGB1-8-T載體和pGL3-neo-luc均經(jīng)XhoⅠ和HindⅢ酶切3小時后，凝膠回收HMGB1目的基因(587 bp)和載體pGL3-neo-luc酶切后片段，用T4連接酶將目的基因片段定向克隆至pGL3-neo-luc的XhoⅠ和HindⅢ位點之間，即為pGL3-HMGB1-3-luc(簡稱3號質(zhì)粒)。

1.2.2 HMGB1-8調(diào)控序列(1 603 bp)熒光素酶報告基因(pGL3-hgmb1-8-luc)的構(gòu)建以3號質(zhì)粒作為載體，同時與hgmb1-8-T載體用KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切，凝膠回收酶切后3號質(zhì)粒的大片段載體(含有587 bp的hgmb1調(diào)控序列)和T載體的1 016 bp目的片段，用T4連接酶將目的片段(1 016 bp)定向克隆至酶切后的3號質(zhì)粒(含有587 bp的hgmb1)KpnⅠ和XhoⅠ位點之間，即獲得pGL3-hgmb1-8-luc熒光素酶報告基因(簡稱8號質(zhì)粒)。

1.2.3 HMGB1-1、2、4、5、6、7調(diào)控序列(166、466、771、1058、1 246、1 410 bp)熒光素酶報告基因的構(gòu)建:以8號質(zhì)粒DNA為模板，分別擴增不同長度的調(diào)控序列片段(166、466、771、1 058、1 246、1 410 bp)，目的片段均連入pMD18-T載體，測序正確后，把各自對應(yīng)的T載體和3號質(zhì)粒經(jīng)KpnⅠ和HindⅢ酶切，用T4連接酶將各自對應(yīng)的目的基因片段定向克隆至3號質(zhì)粒的KpnⅠ和HindⅢ位點之間，即獲得pGL3-HMGB1-1-luc、pGL3-HMGB1-2-luc、pGL3-HMGB1-4-luc、pGL3-HMGB1-5-luc、pGL3-HMGB1-6-luc、pGL3-HMGB1-7-luc熒光素酶報告基因(依次簡稱為1、2、4、5、6、7號質(zhì)粒)。

1.2.4 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、陽性克隆篩選及細胞株構(gòu)建Jurkat細胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基(內(nèi)含100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素)在37℃、5%CO2、相對濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3天傳代1次，調(diào)整細胞密度不超過5×106ml－1。當細胞處于對數(shù)生長期時，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將8個pGL3-HMGB1-luc和pGL3-neo-luc質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Jurkat細胞中，質(zhì)粒均為0.3 μg，詳細轉(zhuǎn)染步驟見說明書和文獻［4］。轉(zhuǎn)染48小時后，開始進行陽性克隆篩選［5］，將細胞以1∶10的稀釋比例轉(zhuǎn)到新鮮的RPMI1640培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)液中加入篩選劑G418(終濃度為600 μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)，以正常培養(yǎng)的Jurkat細胞加入G418為對照，待對照組細胞全部死亡(約20天)，挑取單個細胞克隆至24孔培養(yǎng)板，用含G418(300 μg/ml)的RPMI1640培養(yǎng)液繼續(xù)克隆篩選擴增，持續(xù)加藥篩選2個月以上，在對數(shù)生長期時收集并調(diào)整細胞濃度為6×106ml－1，取其100 μl檢測熒光素酶活性，驗證構(gòu)建的Jurkat-HMGB1穩(wěn)定細胞株。每組設(shè)三個復(fù)孔，實驗重復(fù)三次。構(gòu)建的細胞株依HMGB1調(diào)控片段的有無和長短依次命名為1～8號細胞和NEO細胞。

2 結(jié)果

2.1 HMGB1調(diào)控序列真核表達載體構(gòu)建將587 bp的HMGB1調(diào)控序列插入到pGL3-neo-luc的XhoⅠ和HindⅢ位點之間，成功構(gòu)建出3號質(zhì)粒;將hgmb1調(diào)控序列587 bp的上游片段1 016 bp定向克隆至3號質(zhì)粒的KpnⅠ和XhoⅠ位點之間，成功構(gòu)建出8號質(zhì)粒;將166、466、771、1 058、1 246、1 410 bp的hgmb1調(diào)控序列定向克隆至3號質(zhì)粒的KpnⅠ和HindⅢ位點之間，構(gòu)建出1、2、4、5、6、7號質(zhì)粒。8個質(zhì)粒均經(jīng)KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ雙酶切，電泳顯示條帶與擴增的hgmb1調(diào)控序列長度一致，如圖1所示(圖1B中因1 603 bp中含有HindⅢ酶切位點，pGL3-neo-luc含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位點，故其切出三個條帶)。HMGB1調(diào)控序列T載體的DNA測序結(jié)果與NCBI提供序列完全匹配(圖2)，說明不同長度的HMGB1調(diào)控序列熒光素酶報告基因構(gòu)建成功。

圖1 HGMB1調(diào)控序列熒光素酶報告基因(pGL3-HMGB1-luc)的酶切鑒定Fig.1 The identification of pGL3-HMGB1-luc recombinant plasmid

2.2 HMGB1調(diào)控序列Jurkat穩(wěn)定細胞株的構(gòu)建不同長度HMGB1調(diào)控序列真核表達載體(pGL3-HMGB1-luc)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至Jurkat細胞中，檢測胞漿中的熒光素酶發(fā)光值分別為:123、151 288、136 057、110 623、100 874、214 523、147 597、161 348、145 490(自左至右依次為NEO細胞和1～8號細胞)，驗證細胞系構(gòu)建成功。

圖2 HMGB1調(diào)控序列(1 603 bp)的測序峰圖Fig.2 DNA sequencing map of recombination plasmid

3 討論

人類HMGB1基因定位于13q12染色體上，HMGB1是細胞核內(nèi)一種高度保守高豐度的非組蛋白類染色體結(jié)合蛋白，是由單一基因編碼的結(jié)構(gòu)性轉(zhuǎn)錄因子，主要通過與DNA結(jié)合而參與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、V(D)J重組、修復(fù)、細胞分化及基因表達等多種細胞核生命活動［1，2］。HMGB1具有3個結(jié)構(gòu)域，2個同源的L型DNA結(jié)合區(qū)A box、B box和1個富含天冬氨酸和谷氨酸、帶負電荷的C端酸性尾。A box和B box與DNA具有很高的親和力，前者是引起炎癥反應(yīng)的功能結(jié)構(gòu)域，而A box能夠特異拮抗B box的功能，具有類似HMGB1抗體的功能而競爭性抑制HMGB1的致炎作用，C區(qū)具有調(diào)節(jié)HMGB1與DNA的親和力的作用。生理情況下，HMGB1蛋白組成性表達于所有細胞中。低分化的細胞核中HMGB1高表達，分化成熟的細胞核中HMGB1含量下調(diào)甚至檢測不到。HMGB1具有多種生物學(xué)功能，可作為一種炎性細胞因子，由損傷壞死的細胞被動釋放或活化的單核巨噬細胞主動分泌，并且可再度激活巨噬細胞，產(chǎn)生一系列的病理生理作用［6，7］，被認為是一種重要的“晚期炎癥介質(zhì)”。最近發(fā)現(xiàn)，HMGB1蛋白在多種腫瘤細胞包括肝癌、結(jié)腸癌、淋巴瘤、部分白血病患者骨髓細胞中表達豐富，具有轉(zhuǎn)錄因子和促生長因子的作用，與腫瘤細胞的生長、凋亡、浸潤和轉(zhuǎn)移等病理生理過程有關(guān)［8，9］。

Jurkat為人淋巴細胞瘤細胞，來源于人急性T淋巴細胞白血病，該細胞不含有HTLV1，因此選擇該細胞株為研究Tax蛋白對HMGB1調(diào)控的影響提供了幫助［10］。為了研究HMGB1在ATL中的作用，本研究成功構(gòu)建了HMGB1調(diào)控序列真核表達載體，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至白血病細胞株Jurkat細胞中，篩選并成功構(gòu)建了過表達HMGB1調(diào)控基因的穩(wěn)定細胞株。這些HMGB1調(diào)控序列真核表達載體和HMGB1-Jurkat穩(wěn)定細胞株為找尋起作用的HMGB1調(diào)控區(qū)域，以及闡明Tax蛋白對HMGB1調(diào)控的影響和HMGB1基因在ATL的發(fā)病機制奠定了基礎(chǔ)。

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［收稿2012-03-30 修回2012-06-26］

(編輯 倪 鵬)

Establishment of HMGB1 regulatory gene stable sublines of Jurkat cells

ZHANG Chen-Guang，WANG Hui，NIU Zhi-Guo，SHI Hui-Sen，YIN Ming-Mei，WANG Xue-Ping，HU Ya-Hui，ZHANG Rong-Rong，KONG Hai-Rui，CHEN Yi，HU Li-Hua．
Laboratory of Clinical Medicine，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan430022，China

Objective:To construct and identify luciferase reporter gene vectors containing different-length human high mobility group box 1(HMGB1)gene regulatory sequence and stable expression cell strains of Jurkat cells(Jurkat-HMGB1)，so as to lay a foundation for the further exploring the role of HMGB1 regulatory gene in the pathogenesis of adult T cell leukemia(ALT)．Methods:HMGB1 gene regulatory sequences(－83 bp～+83 bp，－383 bp～+83 bp，－504 bp～+83 bp，－688 bp～+83 bp，－975 bp～+83 bp，－1 163 bp～+83 bp，－1 327 bp～+83 bp，－1 520 bp～+83 bp)were amplified by PCR with DNA as template from Jurkat cells，in which 3’-flanking region were fixed．HMGB1 regulatory genes were ligated into pMD18-T vector respectively and then transformed into E．coli strain DH5a，grown on LB agar plate supplemented with 100 μg/ml ampicillin overnight．The single ampicillinselected DH5a clone was picked for plasmid extraction．The extracted plasmids were digested with the desired restriction enzymes of KpnⅠ/HindⅢor BamHⅠ/HindⅢ．The correctness of HMGB1 regulatory sequence was confirmed with DNA sequencing．The insert of HMGB1 contained in pMD18-T vector was cut out with restriction enzymes(KpnⅠ/HindⅢ)and then ligated into vector pGL3-neoluc to form pGL3-HMGB1-lucs，named according to the length of HMGB1 from short to long in order．PGL3-HMGB1-lucs and pGL3-neo-luc were transiently transfected into Jurkat cells mediated by liposome for 48 hours，the cells were then cultured with G418 at a final concentration of 600 μg/ml for over 20 days．Finally stably transfected sublines of Jurakt cells were obtained after 20 days．And efficiency and validity of stable sublines of HMGB1-Jurkat were testified by luciferase reporter gene activity．Results587 bp-HMGB1 regulatory sequence was firstly ligated into XhoⅠand HindⅢsites of pGL3-neo-luc to get plasmid 3，1016bp-HMGB1 were then ligated into KpnⅠand XhoⅠsites of plasmid 3 to obtain plasmid 8;and 166 bp-，466 bp-，771 bp-，1 058 bp，1 246 bp，1 410 bp-HMGB1 genes were ligated into KpnⅠand HindⅢsites of plasmid 3 to construct recombinant plasmid 1，2，4，5，6 and 7，respectively．PGL3-HMGB1-lucs were confirmed correctly by digesting of KpnⅠ/HindⅢor BamHⅠ/HindⅢand DNA sequencing of HMGB1-T vectors，consistent with the sequence in NCBI to a large extent．And pGL3-hgmb1-lucs were constructed successfully．Following，Jurkat cells were stablely transfected with plasmid pGL3-hgmb1-lucs and pGL3-neo-luc to construct cell HJ 1-8 and cell NEO successfully validated by luciferase luminescence value，which were 151 288，136 057，110 623，100 874，214 523，147 597，161 348，145 490 and 123，respectively．ConclusionpGL3-hgmb1-lucs and stable sublines of HMGB1-Jurkat established successfully provide a basis for looking for meaningful HMGB1 regulatory region and exploring the roles and mechanisms of HMGB1 used in ATL．

HMGB1 regulatory gene;Jurkat cell;Reporter gene;Stable transfection

R392

A

1000-484X(2012)10-0926-04

10．3969/j．issn．1000-484X．2012．10．014

①本文為河南省教育廳重點項目(12A310006)和新鄉(xiāng)醫(yī)院重點研究領(lǐng)域招標課題(ZD2011-13、ZD2011-15)

②新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系，新鄉(xiāng)453003

③新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院2008級、2009級和2010級本科學(xué)生，新鄉(xiāng)453003

張晨光(1972年－)，女，在讀博士，副教授，主要從事分子免疫的研究;

及指導(dǎo)教師:胡麗華(1954年－)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事分子免疫學(xué)方面的研究，E-mail:xh_hlh@126．com。