謝 鋒 孟玉菡 李明清 李大金

(復旦大學附屬婦產科醫(yī)院暨婦產科研究所生殖免疫教研室，上海200011)

胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)是一種IL-7樣細胞因子，最早在胸腺間質細胞株培養(yǎng)上清液中發(fā)現。TSLP是身體和環(huán)境界面(皮膚、呼吸道、腸道、眼組織等)介導Th2反應的關鍵因子。近期研究發(fā)現，除了上皮細胞和表皮角質細胞外，多種細胞包括肥大細胞、呼吸道平滑肌細胞、纖維細胞、樹突細胞(DCs)、滋養(yǎng)細胞以及腫瘤和腫瘤相關細胞均可表達 TSLP［1］。

TSLP參與多種病理生理過程。如通過活化樹突細胞促使CD4+T細胞呈現Th2免疫優(yōu)勢［2］，直接活化T細胞受體促進T細胞增殖、產生Th2型細胞因子和促進B細胞發(fā)育和分化。此外，皮膚T細胞淋巴瘤患者血清TSLP的表達增高［3］。TSLP誘導的Th2型炎性反應與胰腺癌和乳腺癌的進展和預后不良有關［4，5］。我們課題組的前期工作發(fā)現，人早孕期滋養(yǎng)細胞分泌的TSLP能促進自身增殖和侵襲［6］?？紤]到滋養(yǎng)細胞與腫瘤細胞具有相似的生物學特性，因此本研究是在前期研究的工作基礎上，檢測宮頸癌細胞是否表達TSLP，并分析TSLP對宮頸癌細胞的細胞活力的調節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源 人宮頸癌細胞株(HeLa和Cas-Ki)均購自中國科學院細胞庫。

1.1.2 試劑DMEM-F12培養(yǎng)液、胎牛血清為Gibco公司產品;人TSLPELISA試劑盒和人重組的細胞因子TSLP均購自R＆D公司;PE結合的抗人TSLPR流式抗體及其同型對照購自Biolegend公司;MTT購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 ELISA檢測 HeLa和 CasKi細胞培養(yǎng)上清TSLP的濃度 將1×105細胞的HeLa或CasKi細胞接種于24孔板中，分別收集培養(yǎng)24、48和72小時的培養(yǎng)上清。按照人TSLP ELISA試劑盒的操作步驟檢測上清液TSLP的濃度。TSLP檢測敏感度為3.46 pg/ml，板內、板間變異系數＜10%。實驗重復3次，每次設3復孔。

圖1 CasKi和HeLa細胞不同時間上清中TSLP的濃度Fig.1 TSLP concentration in the supernatants of Cas-Ki and HeLa cells

1.2.2 流式細胞術檢測HeLa和CasKi細胞TSLPR的表達 常規(guī)胰酶消化HeLa和CasKi細胞，收獲的細胞加PE標記抗人的TSLPR或同型對照，常溫孵育30分鐘，PBS洗滌后重懸細胞，然后經流式細胞儀(BD FACSCalibur)進行檢測。實驗重復3次，每次設3復孔。

1.2.3 MTT法檢測HeLa和CasKi細胞的細胞活力

將5×103細胞的HeLa或CasKi細胞接種于96孔板中，培養(yǎng)12小時后經無血清DMEM+F12培養(yǎng)液饑餓12小時，然后經溶媒、1、10或100 ng/ml TSLP處理24、48或72小時，隨后MTT法檢測各組細胞的細胞活力。實驗重復3次，每次設6復孔。

1.3 統(tǒng)計學分析 實驗數據輸入SPSS13.0軟件系統(tǒng)，進行t檢驗或One-way ANOVA檢驗，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 CasKi和HeLa細胞均分泌 TSLP 如圖1所示，ELISA結果顯示宮頸癌細胞株CasKi和HeLa細胞均分泌TSLP，并呈現時間依賴性(僅培養(yǎng)24小時的CasKi細胞TSLP分泌水平檢測不出)。與CasKi細胞相比，HeLa細胞早期(24小時和48小時)分泌TSLP水平較高(P ＜0.05或P ＜0.01)，但是隨著時間的進展，培養(yǎng)72小時時兩者TSLP的分泌水平無明顯差異(P ＞0.05)。

圖2 CasKi和HeLa細胞表面TSLPR的表達Fig.2 The expression of TSLPR of CasKi and HeLa cells

2.2 CasKi和HeLa細胞均表達TSLPR 流式檢測發(fā)現培養(yǎng)48小時后的CasKi和HeLa細胞TSLPR陽性表達率分別為 27.07 ±2.13 和 23.61 ±1.30，CasKi細胞表達 TSLPR高于HeLa細胞(P＜0.05，圖2)。

2.3 TSLP增加 CasKi和 HeLa細胞的細胞活力不同濃度細胞因子TSLP作用CasKi和HeLa細胞后MTT法檢測細胞活力，發(fā)現TSLP各濃度組處理的細胞于24小時時不影響CasKi和HeLa細胞的活力(P＞0.05);低劑量組(1 ng/ml)TSLP亦不影響CasKi和 HeLa細胞活力(P＞0.05);而10或100 ng/ml的TSLP處理CasKi和HeLa細胞48或72小時后，均能顯著增強其細胞活力(P＜0.05，圖3)。

圖3 TSLP對CasKi和HeLa細胞活力的調節(jié)作用Fig.3 The regulation of TSLP on the viability of CasKi and HeLa cells

3 討論

TSLP是1994年被發(fā)現，主要由上皮細胞表達的一種造血細胞因子，人TSLP mRNA高表達于皮膚、心臟、肝臟、前列腺、胃腸道、肺和胸腺等器官［7］。最近研究發(fā)現一些腫瘤細胞同樣分泌高水平TSLP，如:纖維母細胞瘤、肺癌、乳腺癌細胞和胰腺癌細胞等。TSLP的受體是由IL-7Rα鏈和TSLPR鏈組成的異質二聚體。其中人TSLPR mRNA全長1 579 bp，含一個由371 aa組成的開放閱讀框，有一個跨膜區(qū)，為Ⅰ型跨膜蛋白，屬于造血細胞因子受體家族。人TSLP/TSLPR參與調節(jié)發(fā)揮多種生物學過程，如調節(jié)先天和獲得性免疫反應，此外在過敏性皮膚病、呼吸道疾病、寄生蟲感染和調節(jié)腸道免疫中具有重要作用。

我們課題組的前期工作已經證實人早孕期滋養(yǎng)細胞來源的TSLP可以劑量依賴的方式促進滋養(yǎng)細胞的增殖和侵襲力［6］。母-胎界面滋養(yǎng)細胞具有獨特的類似于腫瘤細胞的生物學行為，即高增殖和侵襲能力。而國內外的研究未見TSLP與宮頸癌的相關性報道，因此本課題借助ELISA和流式分別檢測了宮頸癌細胞株CasKi和HeLa細胞TSLP和TSLPR的表達特征。我們的結果首次發(fā)現人宮頸癌細胞株CasKi和HeLa細胞均分泌TSLP，且共表達TSLPR，提示TSLP可能以自分泌的方式參與宮頸癌細胞的生物學功能調控。

腫瘤最基本的特征是細胞的失控性生長，腫瘤細胞的不斷增殖是腫瘤侵襲的前提，而增殖活性是腫瘤侵襲轉移的基礎。為解析人重組細胞因子TSLP是否參與對CasKi和HeLa細胞的細胞活力的調控，我們利用MTT試驗檢測發(fā)現，一定濃度的重組細胞因子TSLP處理細胞48或72小時可以增加CasKi和HeLa細胞的細胞活力。

有研究顯示乳腺癌和肺癌細胞表達TSLP，且與腫瘤的增殖和侵襲相關［5，8］。如乳腺癌細胞能以一種依賴TSLP的方式誘導DCs表達OX40L。原發(fā)性乳腺癌浸潤灶中發(fā)現OX40L+DCs。OX40L+DCs在體外促進炎性Th2細胞產生IL-13和TNF。在異種移植模型中，TSLP和OX40L的中和性抗體均能抑制乳腺癌生長和IL-13的產生［5］。因此，乳腺癌細胞來源的TSLP通過誘導DCs表達OX40L，促進炎性Th2微環(huán)境，進而促使腫瘤發(fā)展。

綜上所述，TSLP與宮頸癌增殖和侵襲可能存在一定的關系，對宮頸癌的發(fā)生發(fā)展可能發(fā)揮了一定作用。我們推測TSLP對宮頸癌生長的調節(jié)，一方面可能直接以自分泌的方式，活化下游STAT信號通路來促進宮頸癌細胞的細胞活力;另一方面可能通過調節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境中免疫細胞的功能改變來間接促進宮頸癌細胞的生長。因此進一步解析TSLP調節(jié)宮頸癌細胞生長和侵襲的確切分子機制，對于闡明TSLP在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的調控機制，及宮頸癌的早期預防和臨床治療具有重要的理論意義。

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4 De Monte L，Reni M，Tassi E et al.Intratumor T helper type 2 cell infiltrate correlates with cancer-associated fibroblast thymic stromal lymphopoietin production and reduced survival in pancreatic cancer［J］.JExp Med，2011;208(3):469-478.

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6 Wu H X，Guo P F，Jin L P et al.Functional regulation of thymic stromal lymphopoietin on proliferation and invasion of trophoblasts in human first-trimester pregnancy［J］.Hum Reprod，2010;25(5):1146-1152.

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