邱紅霞 趙陰環(huán) 朱桂啟 趙?；?付冰冰 劉鑫鈺

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院風(fēng)濕免疫科，哈爾濱150086)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種累及多系統(tǒng)多器官的慢性自身免疫性疾病，其特征是免疫系統(tǒng)紊亂，導(dǎo)致抗核抗體(Antinuclear antibody，ANA)等自身抗體的產(chǎn)生、免疫復(fù)合物的沉淀以及補(bǔ)體系統(tǒng)的激活。SLE發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞鉀離子通道 Kv1.3(Voltage-gated potassium channel)和IKCa1(Intermediate-conductance calcium-activated potassium channel 1)對(duì)于啟動(dòng)和維持免疫反應(yīng)至關(guān)重要。本研究檢測(cè)了SLE外周血T細(xì)胞活化時(shí)Kv1.3及IKCa1通道的表達(dá)，以及阻斷Kv1.3通道后對(duì)SLE患者 T細(xì)胞增殖的影響，分析Kv1.3通道在SLE患者T細(xì)胞活化中的作用。探討Kv1.3通道作為SLE免疫治療靶點(diǎn)的可能性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 33例SLE患者來(lái)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科2011年7月至2011年12月的住院患者，其中女性30例，男性3例，平均年齡35歲，所有患者均符合1997年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)修訂的SLE分類標(biāo)準(zhǔn)。采用SLE疾病活動(dòng)指數(shù)(SLEDAI)-2K評(píng)分評(píng)估疾病活動(dòng)性［1］;健康對(duì)照組12人為我院體檢中心的健康人，其中女性8名，男性4名，平均年齡32歲，均無(wú)風(fēng)濕病史和風(fēng)濕病家族史。研究組與對(duì)照組性別、年齡構(gòu)成上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并取得受試對(duì)象的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器和試劑 PCR擴(kuò)增儀(德國(guó) Eppendorf公司);Lightcycler2.0實(shí)時(shí)定量PCR儀(德國(guó)QIAGEN公司，型號(hào) RG-3000);UV-2450紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司);酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)。人淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-Hypaque)(天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?，純化抗人CD3單克隆抗體(美國(guó)eBioscience公司，克隆號(hào)OKT3)，All-in-One qPCR Mix(美國(guó) GeneCopoeia公司)，Allin-One First-Strand cDNA Synthesis Kit(美國(guó)GeneCopoeia公司);Kv1.3、IKCa1 及 β-Actin 引物(美國(guó)Genecopoeia公司，貨號(hào)分別為 Hs-QRP-20905、Hs-QRP-20903、Hs-QRP-20056);ShK(以色列 Alomone公司);CCK-8(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2.1 外周血T細(xì)胞培養(yǎng) 晨起無(wú)菌采集外周靜脈血10 ml，枸櫞酸鈉抗凝。應(yīng)用Ficoll-Hypaque按照操作說(shuō)明密度梯度離心法分離PBMC，之后應(yīng)用尼龍毛柱法提取T細(xì)胞。以含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106ml-1，按照1 ml/孔接種于24孔培養(yǎng)板;每孔中加抗CD3單抗刺激T細(xì)胞活化，終濃度為0.5μg/ml;5%CO2、飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)。

1.2.2.2 熒光實(shí)時(shí)定量PR-PCR檢測(cè)活化 T細(xì)胞中Kv1.3通道和IKCa1通道m(xù)RNA表達(dá)水平 收集培養(yǎng)細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，根據(jù)All-in-One First-Strand cDNA Synthesis Kit(美國(guó)GeneCopoeia公司)說(shuō)明配制反應(yīng)體系，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。據(jù)Allin-One qPCR Mix(美國(guó)GeneCopoeia公司)說(shuō)明配制RT-PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)體系如下:2×All-in-one qPCR Mix 10 μl，PCR 上游引物(2 μmol/L)2 μl，PCR 下游引物(2 μmol/L)2 μl，cDNA 2 μl，去離子水4μl。反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性10分鐘;95℃反應(yīng)10秒，60℃反應(yīng)20秒，72℃反應(yīng)15秒，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。

1.2.2.3 CCK-8 法檢測(cè)阻斷 Kv1.3 通道對(duì) SLE 患者T細(xì)胞增殖的影響 向96孔培養(yǎng)板中加入100 μl細(xì)胞懸液，將細(xì)胞分為抗CD3單抗組和抗CD3單抗+ShK組，設(shè)空白孔，只加含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液及抗CD3單抗。37℃培養(yǎng)72小時(shí)后，向每孔中加入10μl CCK-8溶液，37℃培養(yǎng)4小時(shí)。在酶標(biāo)儀上于450 nm處測(cè)定吸光度OD值。計(jì)算相對(duì)增殖指數(shù):相對(duì)增殖指數(shù)=(不同處理組OD值-空白孔OD值)/(抗CD3單抗組OD值-空白孔OD值。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，對(duì)組間實(shí)驗(yàn)數(shù)值比較采用t檢驗(yàn)，對(duì)Kv1.3和IKCa1通道m(xù)RNA相對(duì)表達(dá)量與補(bǔ)體C3、C4、抗dsDNA抗體、SLEDAI積分及尿蛋白間進(jìn)行相關(guān)性分析。P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 Kv1.3、IKCa1 mRNA表達(dá)情況 利用實(shí)時(shí)定量PCR分析軟件自動(dòng)生成相關(guān)數(shù)據(jù)，分析SLE患者T細(xì)胞活化后與對(duì)照組之間 Kv1.3及 IKCa1的mRNA表達(dá)水平的差異。結(jié)果顯示，Kv1.3通道m(xù)RNA的相對(duì)表達(dá)值為 2.36±0.64，正常對(duì)照為1.04±0.32;IKCa1通道 mRNA 的相對(duì)表達(dá)值為0.77 ±0.19，正常對(duì)照者為 0.98 ±0.19。SLE 患者Kv1.3通道m(xù)RNA的表達(dá)與正常對(duì)照相比明顯增高，而IKCa1通道m(xù)RNA的表達(dá)與正常對(duì)照相比明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為P＜0.001，P=0.006)，如圖1 所示。

表1 SLE組Kv1.3及IKCa1 mRNA表達(dá)水平與補(bǔ)體C3、C4、抗dsDNA抗體、尿蛋白量及SLEDAI積分間的相關(guān)性Tab.1 The correlation between the Kv1.3 and IKCa1 mRNA expression level and complement C3，C4，SLEDAI scores，urinary protein，anti-dsDNA antibody in SLE group

2.2 SLE患者Kv1.3及IKCa1mRNA表達(dá)水平與補(bǔ)體C3、C4、抗dsDNA抗體、SLEDAI積分及尿蛋白間的相關(guān)性分析 SLE患者Kv1.3及IKCa1 mRNA表達(dá)水平均與補(bǔ)體C3、C4、抗dsDNA抗體、SLEDAI積分及尿蛋白無(wú)相關(guān)性。如表1所示。

圖1 SLE組和對(duì)照組Kv1.3及IKCa1 mRNA表達(dá)水平Fig.1 The expression of Kv1.3 and IKCa1 channels in activated T cells of SLE and in controls

圖2 CCK-8法測(cè)SLE T細(xì)胞加入ShK后相對(duì)增殖指數(shù)Fig.2 The effects of blocking Kv1.3 channels with ShK on T cell proliferation were measured by CCK-8 assay

2.3 CCK-8法檢測(cè)阻斷Kv1.3通道對(duì)SLE患者T細(xì)胞增殖的影響 本實(shí)驗(yàn)用CCK-8法檢測(cè)T細(xì)胞的增殖，通過OD值計(jì)算相對(duì)增殖指數(shù)，分析ShK阻斷Kv1.3通道后對(duì)SLE患者T細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，加入ShK后，SLE患者T細(xì)胞的相對(duì)增殖指數(shù)由1.00 ±0.13 降為 0.77 ±0.15，兩者間有顯著差異(P＜0.001)，提示ShK可明顯抑制SLE患者T細(xì)胞增殖，如圖2所示。

3 討論

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞K通道Kv1.3和IKCa1對(duì)于啟動(dòng)和維持免疫反應(yīng)至關(guān)重要。T細(xì)胞表面表達(dá)的兩種主要的K通道是Kv1.3和IKCa1，研究發(fā)現(xiàn)這兩種K通道的表達(dá)與免疫細(xì)胞的活化狀態(tài)有關(guān)［2，3］。在受到抗原的反復(fù)刺激后，CD4+和CD8+T細(xì)胞會(huì)由初始T細(xì)胞分化為TCM和TEM記憶性T細(xì)胞亞群，同時(shí)會(huì)伴隨著T細(xì)胞膜表面鉀離子通道類型的改變。在靜息狀態(tài)，初始T細(xì)胞，TCM細(xì)胞以及TEM細(xì)胞表達(dá)的Kv1.3(200～400個(gè)/細(xì)胞)明顯高于IKCa1(8～10個(gè)/細(xì)胞);受抗原或絲裂原激活后，初始T細(xì)胞和TCM細(xì)胞表達(dá)Kv1.3(250～300個(gè)/細(xì)胞)和 IKCa1(500～600個(gè)/細(xì)胞)的數(shù)量相當(dāng)，而TEM細(xì)胞活化后表達(dá)的Kv1.3(1800個(gè)/細(xì)胞)顯著高于 IKCa1(50～100個(gè)/細(xì)胞)［4］。這說(shuō)明兩種鉀離子通道在活化的初始T細(xì)胞、TCM細(xì)胞和TEM細(xì)胞表達(dá)不同，發(fā)揮的作用也不同。Kv1.3通道是TEM細(xì)胞活化的主要鉀離子通道，而在初始T細(xì)胞和TCM活化時(shí)，IKCa1通道表達(dá)增加，發(fā)揮主要功能［5］。

過去研究發(fā)現(xiàn)在SLE患者中存在一系列的信號(hào)異常，尤其是T細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)抗原刺激的過度應(yīng)答。這種“過度活化”T細(xì)胞的標(biāo)志是，在T細(xì)胞受體(TCR)與抗原肽結(jié)合后，與正常T細(xì)胞相比，表現(xiàn)出更顯著的并且持續(xù)性增加的胞內(nèi)Ca2+水平［6］。持續(xù)的Ca2+內(nèi)流對(duì)下游信號(hào)活化和T細(xì)胞功能起著重要作用。因此，在 SLE患者T細(xì)胞中，胞內(nèi)Ca2+水平調(diào)節(jié)異?？梢詫?dǎo)致T細(xì)胞功能異常。

在T細(xì)胞中TCR介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流是通過鈣釋放活化鈣通道(CRAC)實(shí)現(xiàn)的，并且受多種膜通道和信號(hào)分子的調(diào)節(jié)［7］?？乖c TCR的結(jié)合活化PLC-γ并誘導(dǎo)胞內(nèi)儲(chǔ)存Ca2+釋放。胞內(nèi)儲(chǔ)存Ca2+排空后，引起CRAC通道開放，Ca2+流入胞內(nèi)。持續(xù)的Ca2+內(nèi)流是T細(xì)胞活化所必需的，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。Ca2+內(nèi)流的電化學(xué)驅(qū)動(dòng)力是由陽(yáng)離子通過K通道外流所提供的。

為了研究SLE患者T細(xì)胞中鉀通道的作用，本研究用抗CD3單抗刺激T細(xì)胞活化，分析活化的外周血T細(xì)胞中Kv1.3及IKCa1通道的表達(dá)情況，并分析其與SLEDAI積分、補(bǔ)體、抗dsDNA抗體及尿蛋白的關(guān)系。結(jié)果提示SLE組Kv1.3通道表達(dá)量與正常對(duì)照組相比明顯增加，而IKCa1通道的表達(dá)量與正常對(duì)照組相比減少，這兩種通道的表達(dá)與SLE病情活動(dòng)指標(biāo)SLEDAI積分、補(bǔ)體、抗dsDNA抗體、及尿蛋白之間無(wú)相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)SLE患者中TEM細(xì)胞增加［8］，作為TEM細(xì)胞活化的主要鉀離子通道，Kv1.3通道的活動(dòng)變化可能影響T細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別及T細(xì)胞的活化。選擇性阻斷K通道，可抑制T細(xì)胞活化，從而控制SLE發(fā)病。對(duì)Kv1.3通道的進(jìn)一步研究，有助于研究Kv1.3通道阻斷劑通過調(diào)節(jié)Kv1.3通道來(lái)干擾T細(xì)胞活化的藥理作用及新藥研制。

為了研究Kv1.3通道阻斷劑對(duì)T細(xì)胞增殖的影響，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了CCK-8法檢測(cè)阻斷Kv1.3通道對(duì)SLE患者T細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，ShK可明顯抑制SLE患者T細(xì)胞增殖。這提示Kv1.3通道是SLE患者TEM細(xì)胞活化的主要離子通道，Kv1.3通道可成為SLE免疫治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

鉀離子通道的電生理學(xué)試驗(yàn)表明在SLE患者T細(xì)胞中，Kv1.3通道電流強(qiáng)度比IKCa1高，SLE患者T細(xì)胞中Kv1.3通道表達(dá)量平均為349±30通道/細(xì)胞，IKCa1通道表達(dá)量平均為 30.7±2.5通道/細(xì)胞;并且發(fā)現(xiàn)在IS區(qū)域Kv1.3通道的動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變，與正常對(duì)照者靜止性T細(xì)胞相比，在SLE患者T細(xì)胞中Kv1.3通道轉(zhuǎn)移至IS區(qū)域有更快的動(dòng)力學(xué)。并且這種現(xiàn)象與SLE病情活動(dòng)及是否接受免疫抑制劑治療無(wú)關(guān)［8］。因此，Kv1.3通道是SLE患者T細(xì)胞的主要K電導(dǎo)通道，并且是細(xì)胞電位和鈣平衡的主要調(diào)節(jié)因子。Kv1.3通道狀態(tài)的改變對(duì)SLE患者T細(xì)胞的Ca2+平衡有很多影響。

Rus等［9］對(duì)MS患者腦組織的病理研究證實(shí)，在MS腦組織的血管周圍及脫髓鞘病灶中的T淋巴細(xì)胞上大量表達(dá)Kv1.3通道，其中大部分的T細(xì)胞為TEM細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)在再生障礙性貧血患者中存在 Kv1.3highIKCa1lowTEM細(xì)胞增多，特異性 Kv1.3 阻斷劑ShK可明顯抑制TEM細(xì)胞增殖，并抑制IFN-γ和IL-4的產(chǎn)生［10］。其他體外研究也證明Kv1.3阻斷劑能有效治療多種T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，如大鼠和小型豬的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)性自身免疫型糖尿病，異十八烷誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎和大鼠中變應(yīng)性接觸性皮炎，并沒有出現(xiàn)任何毒副作用［11，12］。在這些疾病模型中，Kv1.3通道阻斷劑選擇性抑制TEM細(xì)胞功能，但對(duì)初始T細(xì)胞和TCM細(xì)胞的歸巢及向淋巴結(jié)的遷移沒有影響［13］，因?yàn)槌跏己蚑CM細(xì)胞可以通過上調(diào)IKCa1通道而逃避免疫抑制，使得正常的免疫應(yīng)答不受影響，靶向Kv1.3通道的治療方法比全身免疫調(diào)節(jié)的治療更有優(yōu)勢(shì)。

Kv1.3通道在抑制自身免疫性疾病的免疫異常中有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但Kv1.3通道阻斷劑可否用于SLE及其他自身免疫性疾病的治療，尚需進(jìn)一步對(duì)Kv1.3通道阻斷劑藥理學(xué)特性、生物利用度及安全性進(jìn)行深入研究。

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