鄢仁晴 方 寧 趙建軍 羅軍敏 羅建波 劉曉燕 (貴州省遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，遵義563003)

結核病是由結核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病，其發(fā)病機制尚未完全闡明。結核病廣泛傳播的潛在危險使得人們再次認識到疫苗開發(fā)研制的重要性。免疫記憶性是疫苗作用的物質(zhì)基礎，在完成初次免疫應答后淋巴細胞大部分被清除，只有極少數(shù)效應T細胞轉(zhuǎn)變?yōu)橛洃浶訲細胞(Memory T lymphocyte，Tm)。如再次遇到相同抗原刺激，此類細胞可介導更快、更強的免疫應答。根據(jù)CD62L和CCR7分子表達的不同可以將記憶性T細胞分為兩大群［1］，一群是 CD62L+和 CCR7+細胞，稱為中央型記憶性T細胞TCM，與初始T細胞相似;主要分布于淋巴組織;而另外一群細胞是CD62L-和CCR7+，稱為效應型記憶性T細胞TEM，主要分布于非淋巴組織，表達向炎癥部位遷移的趨化因子。當受抗原刺激后，中央型記憶性T細胞可轉(zhuǎn)變?yōu)樾陀洃浶訲細胞，發(fā)揮免疫應答功能。動物模型實驗結果顯示［2］:TEM介導了保護性記憶，其遷移到外周炎癥部位并發(fā)揮效應功能;而反應性記憶則由TCM發(fā)揮，其歸巢到次級淋巴器官的T細胞區(qū)，幾乎沒有效應功能，但能穩(wěn)定地增殖并在抗原刺激下分化為效應細胞。IL-17是目前新發(fā)現(xiàn)的由CD4+記憶T淋巴細胞、CD8+細胞等多種細胞分泌的細胞因子，被認為參與了機體多種炎性疾病的發(fā)生。IL-27具有誘導Th1反應促炎性作用和減輕炎性反應雙重作用，在抗感染免疫、抗腫瘤免疫及自身免疫性炎癥等Th1型免疫主導的病理過程中起重要作用。國外鮮見人肺結核外周血記憶性 T細胞的報道［3，4］，國內(nèi)學者做過相關基礎研究［5-7］，但未見肺結核患者外周血記憶性T細胞的報道，國外少見肺結核與IL-17、IL-27的相關研究報道［8-10］。所以擬以 CD4+(CD8+)CD45RA-CD62L-CCR7+作為效應型記憶性T細胞(Effector memory T cell，TEM)表面標志，CD4+(CD8+)CD45RA+CD62L+CCR7+作為中央型記憶性T細胞(Central memory T cell，TCM)表面標志，用以探討肺結核患者外周血記憶性T細胞亞群的表達以及與IL-17、IL-27水平的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 患者組 收集2011年1月到12月30例住院病人及門診病人，經(jīng)呼吸內(nèi)科臨床診斷的繼發(fā)性肺結核(包括浸潤性肺結核、纖維空洞性肺結核及干酪性肺炎等)。參照《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準WS288-2008肺結核診斷標準》:a.兩次痰標本涂片鏡檢抗酸桿菌陽性或分離培養(yǎng)分支桿菌陽性。b.胸部X線攝片顯示肺結核征象。具有咳嗽、咳痰、疲乏、胸悶氣短、胸痛、低燒、食欲不振、血痰或咯血、體重減輕、月經(jīng)失調(diào)等癥狀。c.五個單位結核菌素(OT或PPD-T)皮內(nèi)注射，72小時注射局部硬結反應直徑≥5 mm。d.肺部病理標本(手術、纖維支氣管鏡檢、肺穿刺等)經(jīng)病理學診斷為結核病變。具備a、b，或同時伴有c，d中一項者或同時具備a、d者，均可確診。

分組:(1)參照《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準結核病分類》中化療史規(guī)定把患者分為初治組和復治組;初治組為凡既往未用過抗結核藥物治療或用藥時間少于一個月的新發(fā)病例;復治組為凡既往應用抗結核藥物一個月以上的新發(fā)病例、復發(fā)病例、初治治療失敗病例等。(2)根據(jù)痰涂片抗酸染色分組:陽性為痰涂陽組，陰性為痰涂陰組。

所有病例均無心、肝、腎等臟器合并癥及其它感染，無糖尿病、腫瘤等免疫相關性或免疫性疾病，4個月內(nèi)未用過激素及免疫抑制劑，均在抗結核治療前采血。其中初治8例，復治22例。痰涂陽9例，痰涂陰21例。男/女:16/14例，平均年齡36歲，最大68歲，最小13歲。

1.1.2 健康對照組 隨機選擇20例健康正常者，均排除心、肝、腎等疾病，男/女:12/8例，平均年齡38歲，最大52歲，最小15歲。

1.2 標本收集 記憶性T細胞數(shù)量檢測:無菌操作取患者組及對照組清晨空腹靜脈血5 ml于EDTANa2抗凝管中，立即輕搖混勻，室溫保存，6小時內(nèi)測定。IL-17、IL-27水平檢測:取普通管抽取靜脈血3 ml，分離血清，-20℃冰凍保存，待測。

表1 肺結核患者外周血記憶性T細胞亞群的表達(中位數(shù)，最小值，最大值，%)Tab.1 Expression of memory T cell subgroups in peripheral blood of pulmonary tuberculosis patients(median，min，max，%)

表2 肺結核患者血清IL-17和IL-27表達水平(ng/L)Tab.2 Level of IL-17 and IL-27 in peripheral blood of pulmonary tuberculosis patients(ng/L)

1.3 試劑及儀器 試劑:CD4-Percp、CD8-Percp、CCR7(CD197)-PE、CD45RA-FITC、CD62L-APC、鼠IgG1-PE、鼠IgG2a-PE、FACS溶血素、裂解液均購自美國BD公司;人IL-17、IL-27酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自美國R＆D systems公司;儀器:BD-FACSCalibur流式細胞分析儀(美國BD公司)，DNM-9602G酶標分析儀(北京普朗新技術有限公司)。

1.4 流式分析操作方法 用流式細胞術檢測EDTANa2抗凝的外周血記憶性T細胞:取100μl待檢樣本，分別加入 CD4-Percp、CD8-Percp、CCR7(CD197)-PE、CD45RA-FITC、CD62L-APC標記抗體。按照常規(guī)方法進行標記，設相應的同型對照，室溫閉光反應30分鐘，然后加2 ml溶血劑，5分鐘后離心去上清，再加0.5～1.0 ml的 PBS液洗滌2次，流式細胞儀檢測，CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)，記錄陽性細胞百分率，減去非特異對照值，樣品在6小時內(nèi)檢測完畢。

1.5 ELISA雙抗夾心法 測定肺結核患者外周血中IL-17、IL-27的含量。按照試劑盒說明書操作，應用酶標儀定量檢測。

表3 肺結核患者記憶性T細胞亞群與IL-17/IL-27的相關性(r)Tab.3 The correlation analysis between memory T cells subgroups and IL-17/IL-27 in pulmonary tuberculosis patients(r)

1.6 統(tǒng)計學處理 檢驗數(shù)據(jù)是否成正態(tài)分布，成偏態(tài)分布，采用中位數(shù)(最大值，最小值)描述數(shù)據(jù)，統(tǒng)計方法采用Wilcoxon秩和檢驗，相關性分析采用Spearman秩相關，成正態(tài)分布采用均數(shù)標準差描述數(shù)據(jù)，統(tǒng)計采用兩樣本均數(shù)T檢驗，相關性分析采用泊松分析。

2 結果

2.1 流式細胞儀分析記憶性T細胞亞群 CD4+TEM 初治組和復治組，涂陽組和涂陰組均高于健康對照組(P＜0.05);CD4+TCM:初治組高于復治組 (P＜0.05)，涂陰組高于涂陽組(P＜0.05);CD8+TEM:初治組與涂陰組均低于健康對照組(P ＜0.05)，初治組低于復治組(P ＜0.05)，涂陰組低于涂陽組(P＜0.05);CD8+TCM:涂陰組高于涂陽組(P ＜0.05)，見表1。

2.2 ELISA法檢測肺結核患者外周血清IL-17/IL-2 7水平 IL-17復治組低于初治組和健康對照組(P＜0.05);IL-27:復治組高于初治組和健康對照組 (P ＜0.05)，見表2。

圖1 1例肺結核患者CD4+/CD8+記憶性T細胞流式分析圖譜Fig.1 One result of pulmonary tuberculosis patients of CD4+/CD8+memory T cells analyzed by flow cytometry

表4 肺結核患者IL-17與IL-27的相關性(r)Tab.4 The correlation analysis between IL-17 and IL-27 in pulmonary tuberculosis patients(r)

2.3 相關性分析 患者組CD4+和CD8+記憶T細胞與 IL-17、IL-27水平比較無顯著相關性(P＞0.05)，患者IL-17與IL-27比較有顯著相關性(P＜0.05)，見表3、4。

2.4 流式分析圖譜 第一行圖譜R1為外周血淋巴細胞，R2是單核細胞，R3是中性粒細胞，第二行圖譜M1是CD4+和CD8+細胞，第三行圖譜R5是CD45RA+、CD62L+的 細 胞，R6 是 CD45RA-、CD62L-的細胞，第四行圖譜 CD45RA+、CD62L+、CD197+的細胞，第五行圖譜 CD45RA-、CD62L-、CD197+的細胞，如圖1。

3 討論

因為結核病流行形勢的嚴峻和卡介苗抗結核保護作用的有限，故抗結核新疫苗的研制一直為人們所關注。結核分枝桿菌屬胞內(nèi)寄生菌，以T細胞免疫為主。記憶性T細胞在數(shù)量上、細胞膜表面分子的表達、細胞因子的產(chǎn)生和功能等方面均與初始T細胞有明顯不同［11］。

我們采用多種染色流式細胞術檢測，以及國內(nèi)外常用鑒別記憶性T細胞表型標志的抗體，在單個細胞水平上檢測肺結核患者外周血CD4+(CD8+)記憶性T細胞亞群的表達。結果表明患者組CD4+TEM表達水平均高于健康對照組，與文獻報道相符［12-14］。肺結核是以Th1型細胞免疫來對付侵襲的結核分枝桿菌，CD4+效應型記憶性T細胞在急性炎癥期表達增高，可以為機體提供免疫記憶保護。繼發(fā)性肺結核患者外周血CD4+TEM表達水平明顯高于正常人，可望作為臨床診斷繼發(fā)性肺結核的新型指標;CD8+TEM初治組與涂陰組均低于健康對照組(P＜0.05)，初治病例體內(nèi)免疫反應向Th1方向極化，CD8+TEM帶有大量的顆粒酶和穿孔素，可對吞噬了大量抗原的靶細胞進行呈遞和殺傷，CD8+TEM在結核感染初期或活動期降低，與CD8+T功能細胞介導的細胞免疫反應一致。有學者認為CD8+T細胞的數(shù)量降低是結核病治療失敗和復發(fā)的重要原因［15］，本研究提示CD8+TEM降低，因此在研制新型結核疫苗中迫切需要解決如何提高CD8+T細胞的數(shù)量及其免疫應答效率。

復治組CD4+TCM顯著低于初治組(P＜0.05)，復治組CD8+TEM細胞顯著高于初治組(P＜0.05)，CD4+TCM記憶性T細胞在體內(nèi)長期存在，在復治組表現(xiàn)為對原來抗原的再次入侵產(chǎn)生快速而強烈的克隆增殖反應，并能有效地刺激樹突狀細胞，輔助B細胞，產(chǎn)生免疫效應。在外周表現(xiàn)為數(shù)量減少，也可能為復治期CD4+中央型轉(zhuǎn)變?yōu)樾陀洃浖毎?，發(fā)揮免疫應答功能。復治組CD8+TEM增高是否由于結核菌的耐藥，不能對靶細胞進行呈遞和殺傷，因此存活的CD8+TEM增加，還需進一步探討。

涂陰組CD4+TCM顯著高于涂陽組 (P＜0.05)，涂陰組 CD8+TEM顯著低于涂陽組(P＜0.05)，涂陰組 CD8+TCM顯著高于涂陽組(P＜0.05)。通常涂陽組患者由于長期帶菌，結核分枝桿菌在抗原刺激和自穩(wěn)細胞因子的作用下使得TCM分化為TEM，因此涂陽組TCM減少［16］。

范艷等［8］研究顯示機體外周血中存在著卡介苗(BCG)特異性記憶CD4+T細胞，這些記憶T細胞在體內(nèi)的產(chǎn)生是由于BCG免疫后所誘導，還是環(huán)境中分枝桿菌所致，需要進一步探討。據(jù)本研究可以推斷結核分枝桿菌的免疫反應是可以產(chǎn)生特異性的CD4+記憶性T細胞，但是CD8+記憶性T細胞可能參與細胞殺傷作用而數(shù)量有所下降。

復治組IL-17水平低于健康對照組和初治組，與文獻［17］報道相符 ，IL-17在招募中性粒細胞聚集感染部位吞噬結核桿菌的同時也加重了感染部位的炎癥反應。項杰等［18］報道結核病未治療組患者的IL-17水平升高，炎癥加重，經(jīng)治療一段時間后IL-17水平明顯下降，炎癥反應降低，因此IL-17參與了機體抗結核桿菌感染的免疫反應。復治組IL-27水平高于健康對照組和初治組，與文獻［19］報道相符，在炎癥早期，IL-27可以通過JAK/STATs途徑來促進CD4+T細胞、CD8+T細胞、NK細胞、肥大細胞和單核細胞活化增殖產(chǎn)生炎性細胞因子IFN-γ、IL-1、IL-12、IL-18 和 TNF.［20］。記憶 T 細胞表達 IL-27受體，當受體缺失時，炎癥性細胞因子激活、IL-27產(chǎn)生增多［21］。IL-27在結核菌感染過程中發(fā)揮雙重作用，雖然阻止了抗結核菌的保護性免疫反應，但可以限制慢性炎癥造成的最終病理損害［22］。由此提示IL-17、IL-27參與了抗感染免疫的炎癥介導過程，尤其是參與了Th1型免疫主導的病理過程。各患者組IL-17、IL-27水平有顯著相關性，進一步證實兩者均參與了結核的抗感染免疫，有學者認為IL-27可以通過JAK/ST AT1途徑抑制活化CD4+T細胞產(chǎn)生 IL-17［23，24］。IL-17、IL-27 水平與記憶性 T 細胞的數(shù)量無明顯相關性，提示IL-17、IL-27可能未參與抗結核的免疫記憶過程，具體原因尚需進一步研究。

綜上所述，肺結核患者外周血CD4+TEM記憶性T細胞的表達水平可望作為肺結核初步診斷的臨床觀察指標，CD4+TCM和CD8+TEM兩者均可望作為肺結核患者的臨床分組依據(jù)。IL-17、IL-27可用于判斷肺結核的炎癥程度。我們將深入探討肺結核記憶性T細胞的變化，為CD4+和CD8+記憶性T細胞新型結核疫苗的研制打下基礎。

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